南方科技大学生物医学工程系，广东 深圳 518055
由于衍射极限的存在，传统的光学成像手段无法观测细胞器结构及细胞器之间的相互作用。单分子定位显微成像技术作为三种超分辨技术中分辨率最高的成像技术，为生命科学领域的研究提供了重要手段。大视场高通量单分子成像技术具有分辨率高、成像范围大和成像时间短等特点，在生物医学领域广泛用于观察和分析复杂的生物结构和功能。从基于硬件扫描的拼接成像技术、基于大面阵sCMOS的大视场高通量成像技术、大景深单分子定位成像技术、高通量数据分析技术4个方面回顾近年来大视场高通量单分子定位技术的研究进展。最后，对大视场高通量单分子定位成像技术的发展方向进行展望。
高通量 大视场 单分子定位显微镜 超分辨成像 激光与光电子学进展
2024, 61(6): 0618004
Author Affiliations
Abstract
1 Institute for Quantum Science and Technology, College of Science, National University of Defense Technology, Changsha 410073, China
2 Hunan Key Laboratory of Mechanism and Technology of Quantum Information, Changsha 410073, China
3 School of Physics and Astronomy, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ, UK
The 3D location and dipole orientation of light emitters provide essential information in many biological, chemical, and physical systems. Simultaneous acquisition of both information types typically requires pupil engineering for 3D localization and dual-channel polarization splitting for orientation deduction. Here we report a geometric phase helical point spread function for simultaneously estimating the 3D position and dipole orientation of point emitters. It has a compact and simpler optical configuration compared to polarization-splitting techniques and yields achromatic phase modulation in contrast to pupil engineering based on dynamic phase, showing great potential for single-molecule orientation and localization microscopy.
PSF engineering geometric phase single-molecule orientation and localization microscopy Chinese Optics Letters
2024, 22(3): 031103
国家纳米科学中心中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室，北京 100190
超分辨显微成像技术自诞生以来，凭借其优异的纳米级空间分辨率，已成为生命科学研究中精准揭示复杂生命现象的重要成像技术。其中，基于单分子定位的超分辨成像策略，使得定位、观察、研究单个探针分子独特的理、化、光学性能成为可能。偏振作为荧光信号的一个重要特性，近年来伴随着单分子三维取向成像技术的发展，逐步在单分子成像和超分辨领域中展示出诸多新颖且重要的应用特性。本文总结了单分子三维取向超分辨成像技术的最新进展，介绍并分析了两类主要的单分子三维取向荧光显微技术——基于荧光吸收与辐射偏振调制的单分子三维取向成像方法以及利用点扩散函数工程将单个荧光分子的三维取向信息编码到荧光图像上的成像策略。此外，还探讨了应用于活细胞或单颗粒的其他类型的超分辨取向成像技术。最后，针对单分子三维取向超分辨成像技术发展与应用前景面临的挑战，进行了总结与展望。
显微 单分子荧光 超分辨成像 单分子空间取向 单分子定位显微术 激光与光电子学进展
2024, 61(6): 0618015
1 浙江大学光电科学与工程学院，极端光学技术与仪器全国重点实验室，浙江 杭州 310027
2 浙江大学杭州国际科创中心，浙江 杭州 311215
荧光超分辨显微技术自20世纪90年代诞生以来，经历了多代创新与发展，其空间分辨率已经远超衍射极限，横向分辨率能够达20 nm以下，可以实现分子尺度的生物成像与动态追踪。新一代超高分辨率显微技术的产生得益于传统超分辨技术的深度发展和结合创新。详细介绍横向分辨率在亚20 nm尺度的新一代荧光超分辨显微技术，并阐述其与传统超分辨原理的联系与区别。此外，针对分辨率的限制因素，就光学系统、扫描策略和样品制备等方面进行探讨，并展望高分辨率荧光显微技术在生物医学领域中的应用前景和发展方向。
荧光显微 超分辨成像 调制照明 单分子定位 扫描策略 激光与光电子学进展
2024, 61(2): 0211004
细胞内存在大量性质各异的大分子复合物，它们是控制生命活动的核心信号枢纽。荧光显微成像因其分子特异性、细胞原位可视化和多色标记解析等优势，已成为当今生物学研究不可或缺的技术手段。而突破光学衍射极限的超分辨光学成像技术为进一步理解多种重要生物百纳米信号体的原位结构和功能调节提供了亚细胞尺度甚至单分子精度的研究思路和方案。首先阐述了超分辨成像和单分子定位显微镜的基本原理，介绍了近年来在多项生命科学研究中的代表性应用案例，结合实际研究经验总结了超分辨光学成像技术在使用中面临的诸多挑战和未来发展方向，提出了基于原位纳米成像解析信号枢纽组织结构将有力促进新型疾病治疗靶点和策略的开发。
生物光学 超分辨成像 单分子定位 生物信号体 信号转导
1 弱光非线性光子学教育部重点实验室，南开大学物理科学学院，泰达应用物理研究院，天津 300071
2 药物化学生物学全国重点实验室，南开大学生命科学学院，细胞应答交叉科学中心，天津 300071
3 南开大学深圳研究院，广东 深圳 518083
4 山西大学极端光学协同创新中心，山西 太原 030006
核孔复合物（NPC）是细胞核膜上由多种蛋白组装而成的复杂结构，在细胞核质交换和信息传递中起着关键作用。单分子定位超分辨成像（SMLM）以其特异性和高成像分辨率成为研究NPC超微结构的主要方法之一。然而，由于抗体标记不完全等因素导致的数据丢失，给后续分析带来了困难。笔者使用SMLM提供的定位信息，结合基于密度的空间聚类算法（DBSCAN）和层次聚类算法进行数据的提取和分类，建立了NPC筛选和定位的分析流程，并采用该处理流程得到了缺失较少且形貌比较均匀的核孔。进一步，基于最小二乘法原理对筛选得到的大量NPC进行质心对齐的重构处理，成功复现出了其经典的八重对称结构，并揭示了核孔蛋白Nup133与Nup98的精确相对位置关系。本研究通过建立核孔筛选和重构的标准流程，填补了SMLM数据的缺失。采用该流程对多种核孔蛋白进行分析，揭示它们的结构特性。所建流程为理解核孔的复杂结构提供了一种高通量的定量分析方法。
生物光学 超分辨成像 单分子定位 核孔复合物 聚类算法 重构
上海理工大学 光电信息与计算机工程学院, 上海 200093
单分子免疫检测,是指将免疫复合物限制在极小的体积内,对产生的信号进行计数,是一种“数字化”的免疫检测技术。单分子免疫检测仪的核心类似于一个荧光显微系统,但普通的荧光显微镜结构复杂,且与生物芯片规格无法匹配,不能很好地满足检测需求。针对自行研制的生物芯片规格,合计了一套高性能的单分子免疫检测光学系统。根据设计要求,确定了合适的初始结构; 在荧光显微系统原理和像差分析理论的基础上,使用光学设计软件Zemax对系统进行反复优化设计; 设计出了满足单分子免疫检测成像要求的光学系统。系统的成像部分由15片折射透镜组成,工作距离为4mm,放大倍率为-4.52,调制传递函数值在奈奎斯特频率73lp/mm处均大于0.44,畸变为0.8%,照明部分采用柯勒照明方式,在整个视场范围内,物面上的照度均匀度达到97%。整个系统采用国产常规玻璃,有利于加工和降低成本。经优化后的高分辨率荧光显微系统结合当前发展成熟的全自动化检测技术,可以极大提高单分子免疫检测的检测灵敏度和准确率。
单分子免疫检测 生物芯片 光学设计 荧光成像系统 照明设计 高分辨率 single molecule immunoassay biochip optical design fluorescence imaging system lighting design high resolution
Author Affiliations
Abstract
1 Key Laboratory of Biomedical Engineering of Hainan Province, School of Biomedical Engineering, Hainan University, Haikou 570228, P. R. China
2 School of Computer Science and Technology, Hainan University, Haikou 570228, P. R. China
3 Wuhan National Laboratory for Optoelectronics, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, P. R. China
Quantitative data analysis in single-molecule localization microscopy (SMLM) is crucial for studying cellular functions at the biomolecular level. In the past decade, several quantitative methods were developed for analyzing SMLM data; however, imaging artifacts in SMLM experiments reduce the accuracy of these methods, and these methods were seldom designed as user-friendly tools. Researchers are now trying to overcome these difficulties by developing easy-to-use SMLM data analysis software for certain image analysis tasks. But, this kind of software did not pay sufficient attention to the impact of imaging artifacts on the analysis accuracy, and usually contained only one type of analysis task. Therefore, users are still facing difficulties when they want to have the combined use of different types of analysis methods according to the characteristics of their data and their own needs. In this paper, we report an ImageJ plug-in called DecodeSTORM, which not only has a simple GUI for human–computer interaction, but also combines artifact correction with several quantitative analysis methods. DecodeSTORM includes format conversion, channel registration, artifact correction (drift correction and localization filtering), quantitative analysis (segmentation and clustering, spatial distribution statistics and colocalization) and visualization. Importantly, these data analysis methods can be combined freely, thus improving the accuracy of quantitative analysis and allowing users to have an optimal combination of methods. We believe DecodeSTORM is a user-friendly and powerful ImageJ plug-in, which provides an easy and accurate data analysis tool for adventurous biologists who are looking for new imaging tools for studying important questions in cell biology.
Journal of Innovative Optical Health Sciences
2023, 16(6): 2350006
哈尔滨工业大学仪器科学与工程学院，黑龙江 哈尔滨 150080
单分子定位技术通过随机激发荧光标记获得一组稀疏的图像序列，同时对荧光点进行亚像素级别定位，最终实现超分辨显微成像。基于拟合的单分子定位算法，如单发射（SE）及多发射（ME）定位算法，通过对估计器性能进行改进提高了单分子定位的精度和速度；然而，受失配误差和串扰误差的影响，SE算法和ME算法在不同密度情况下各有优劣，均无法达到全密度范围内最优的估计效果，并且分别存在荧光分子利用效率低和计算量大的缺点。本文提出了自适应混合发射单分子定位（SM）算法，该算法通过图像荧光发射密度及强度自适应地确定的拟合区域以及所采用的拟合模型及模型初值，有效避免了上述两种误差的影响，达到了全密度范围内一致、良好的定位效果。在仿真和实验数据上将所提SM算法与SE算法、ME算法进行比较，结果显示，SM算法重构图像的分辨率和对比度在不同发射密度下均具有优势。
生物医学 单分子定位显微技术 超分辨成像 单发射模型 多发射模型 自适应算法 中国激光
2023, 50(21): 2107106
Author Affiliations
Abstract
1 Huazhong University of Science and Technology, Wuhan National Laboratory for Optoelectronics and School of Physics, Wuhan, China
2 University of Connecticut, Department of Physics, Storrs, Connecticut, United States
3 Wuhan Institute of Technology, Hubei Key Laboratory of Optical Information and Pattern Recognition, Wuhan, China
4 Kansas State University, Department of Physics, Manhattan, Kansas, United States
In quantum mechanics, when an electron is quickly ripped off from a molecule, a superposition of new eigenstates of the cation creates an electron wave packet that governs the charge flow inside, which has been called charge migration (CM). Experimentally, extracting such dynamics at its natural (attosecond) timescale is quite difficult. We report the first such experiment in a linear carbon-chain molecule, butadiyne (C4H2), via high-harmonic spectroscopy (HHS). By employing advanced theoretical and computational tools, we showed that the wave packet and the CM of a single molecule are reconstructed from the harmonic spectra for each fixed-in-space angle of the molecule. For this one-dimensional molecule, we calculate the center of charge ⟨ x ⟩ ( t ) to obtain vcm, to quantify the migration speed and how it depends on the orientation angle. The findings also uncover how the electron dynamics at the first few tens to hundreds of attoseconds depends on molecular structure. The method can be extended to other molecules where the HHS technique can be employed.
attosecond charge migration high-harmonic spectroscopy single-molecule harmonic dipole machine learning Advanced Photonics
2023, 5(5): 056001
