研究分析植物细胞的光学特性为获得近衍射极限图像的自适应光学显微镜奠定了基础。

　　使用光学显微镜进行活体成像可以观测活细胞、组织和有机物体，对生物研究至关重要。荧光蛋白的发现和荧光探针的发展，使我们能够通过将活体细胞中的荧光探针和荧光显微镜结合起来监控感兴趣分子的动态。然而，活细胞和组织是由不同折射率有机物的复杂结构组成的，其中，光的振幅受到干扰、波前会失真。因此，随着对活体组织观测深度的增加图像质量出现下降。植物细胞折射光比动物组织更严重，甚至在单个细胞内，图像都会被大幅度降级。

　　自适应光学(AO)就是该问题的一个解决方案，起初是为天文望远镜校正大气湍流引起的波前畸变而开发的，因而实现地基望远镜对天体目标的清晰成像。 AO需要参考光源，例如一个导星;由三个主要部分组成：波前传感器、控制单元和空间光调制器。首先，波前传感器测量参考光源光的波前畸变。基于该测量数据，控制单元驱动调制器来校正波前畸变。这个过程作为一个“闭环”控制系统重复进行，使波前保持接近平面的状态。 最近，AO用于显微镜进行精细活体成像已经成为一个研究活跃的方向，这也是我们研究工作的主题。

　　目前，AO显微镜观测的大部分对象是动物的细胞和组织。而我们的研究对象是植物。因此，我们寻求开发一种植物细胞活体成像AO显微镜。我们使用了苔藓小立碗藓叶作为样本，因为它的单细胞层适合光学分析。另外，它具有很强的诱导干细胞的能力，这是有趣的生物研究。

　　图1 植物细胞的光学特性的分析。(a)相位对比和(b)立碗藓叶细胞的亮场图像(箭头指向叶绿体)。(c)使用附着荧光珠的一片小立碗叶的点扩散函数的分析模型示意图。该模型是用于获得(e)中的模糊图像的实验。箭头指向影响波前的叶绿体层，也是(a，b)图像中的焦平面。叶细胞的尺寸显示的比实际的大。，(d–f)是从物镜方向看附着在小立碗藓叶细胞上面(d)和下面(f)的荧光珠的图像。使用了一片正常叶(d，e)和一片质壁分离叶(f)。(e,f)中左面板的亮度被调整至(d)。标尺条：20微米(a，b)和2微米(d-f)。

　　首先，分析植物细胞的光学特性，确定AO 显微镜的技术指标。我们用相差显微镜观测这些细胞，测量活体植物细胞的相位延迟，注意到叶绿体中白到黑对比度很强：参见图1(a)。这表明叶绿体干扰了光波前：图1(b)是用作参考的亮场图像。我们还使用附着在叶片上的390纳米荧光珠观测点扩散函数(PSF)：参见图1(c)。

　　我们获得了植物细胞上面紧贴物镜(顶端)的荧光珠的清晰图像：参见图1(d)。相比之下，当观察到附着于细胞的反面(底层)荧光珠时，珠的图像严重退化：参见图1(e)。然而，在只有细胞壁的区域，图像降级非常轻微(无叶绿体或其它细胞组分)：参见图1(f)。这是由于质壁分离即原生质(细胞核和细胞质)的收缩导致的。这些发现结果表明，叶绿体是植物细胞图像质量下降的主要原因。

　　所以，我们主要校正由叶绿体引起的相差，然后确定AO显微镜主要技术指标：参见图2(a)。我们一般采用60x水浸物镜(NA=1.2)来观察植物细胞结构。当该镜头用于观察细胞的深层时，焦平面和叶绿体层之间的距离通常为15μm。叶绿体层——图1(c)的箭头所指——大约60μm直径的圆圈，其中，从焦平面上一点来的光线在到达物镜之前会穿过该圆圈。叶绿体是球形的，典型直径大约为5μm。

　　图2 用我们的AO显微镜校正后的叶绿体图像。(a)该AO显微镜的结构。DEM：变形镜;BS：分束器;WSF:波前传感器。CCD：电荷耦合器件。((b,c)处于植物细胞深层的叶绿体没有校正(b)和经过校正的图像(c)标尺条：5微米。

　　这表明，12×12单元可以有效校正叶绿体引起的像差的基本空间频率。因此，我们为显微镜选用了12×12单元变形镜(Thorlabs公司的AOK1- UP01)。还使用通过变形镜的绿光光斑激发叶绿体。用这种自发荧光光斑作为参考源，类似于天文AO的激光导引星。AO显微镜的闭环运行提高了激光引导星使绿光更加收敛、自发荧光斑更加集中。我们成功获得了植物细胞深层叶绿体的衍射极限图像：参见图2(b, c)。

　　总之，当光线经过植物细胞时，被严重干扰，甚至在一个活体植物细胞中图像质量就下降了。我们开发AO显微镜校正畸变光使活植物细胞的精细成像成为现实。目前AO的一个局限是校正的视场比较窄。为了扩大市场，天文领域开发人员已经研究了3D AO，如多目标或多共轭AO。AO显微镜由于其小型和廉价对推进3D AO的研究和开发非常有用。今后，我们计划使用3D AO进行研究，增大用于植物细胞活体精细成像的AO显微镜的校正视场。

　　(付小芳 编译自Adaptive optics microscopy for fine imaging of live plant cells，

　　www.spie.org，2016-03-9)