1　引言

刺激响应型材料具有广阔的应用前景，包括软机器人、柔性电子器件、致动器、生物医学设备和药物递送等^［1-5］。许多智能材料已被广泛应用于四维（4D）打印，包括液晶弹性体、形状记忆聚合物和刺激响应型水凝胶等^［6-8］。牛血清白蛋白（BSA）作为天然蛋白之一，由于其低成本、无毒、生物降解性、生物相容性、刺激响应特性以及与人血清白蛋白相似的性质，已被广泛研究^［9-10］。值得注意的是，基于BSA的动态可调和响应迅速的“智能”三维（3D）微结构具有明确的几何形状和可重复性，对于再生医学和组织工程至关重要。

在体内生物医学与药物递送应用中，人们希望器件具有微纳米级的尺寸^［11-12］。为了更好地满足合成的微观结构在规模和精度上的不同需求，研究者开发了多种微制造技术来构建三维（3D）水凝胶，如立体光刻技术^［13］、软光刻技术^［14-15］、数字光投影技术^［16-20］、电子束光刻^［21-22］和生物打印技术^［23］。然而，高效制备任意形状且具有高分辨率的三维结构仍是一项挑战^［24］。双光子聚合（TPP）作为一种飞秒激光直写技术，可将透明聚合物溶液快速聚合成任意形状的高分辨率3D微结构，已广泛应用于微纳光子学^［25］、微流控^［26］、组织工程^［27-31］和药物递送^［32-34］等领域^{［32， 35-37］}。

本课题组前期自主合成了一系列基于BSA的甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）酸化的BSA-GMA生物材料^［38］，发现其具有更好的双光子聚合特性。本研究重点探索了利用飞秒激光直写制备3D水凝胶微结构及其pH响应性和生物相容性。首次全面研究了具有不同浓度和甲基丙烯酸化度的宏观与3D微结构的BSA-GMA的pH响应能力，以及BSA-GMA 3D水凝胶微结构的生物相容性。研究结果表明，BSA-GMA水凝胶的浓度越大或甲基丙烯酸化度越小，BSA-GMA的pH响应程度越大。因为BSA-GMA材料的双光子聚合发生在GMA链上的C=C处，因此可以通过改变甲基丙烯酸化程度进一步改变交联密度，并且双光子聚合过程不消耗氨基酸基团，使得BSA-GMA材料的pH响应能力和三维结构的稳定性均比BSA水凝胶的更好。BSA-GMA水凝胶具有pH响应的原因是BSA上的氨基和羧基在不同pH条件下的质子化和电离导致的静电排斥作用。由于改性过程中，一个赖氨酸基团可以接枝两个GMA基团，提高了接枝效率，在后续的飞秒激光直写双光子聚合中BSA-GMA的交联密度得到提高，因此BSA-GMA材料可以制备出更稳定的3D微结构。共聚焦荧光图像与细胞的增殖结果表明，BSA-GMA水凝胶无细胞毒性，有利于细胞的黏附与增殖。这种具有可调的pH响应性、良好生物相容性和精细3D结构的蛋白质水凝胶在生物医学领域具有广泛的应用潜力。

2　实验部分

2.1　实验试剂与仪器

本研究中用到的主要试剂包括：BSA-GMA（自主合成；苯基（2，4，6-三甲基苯甲酰基）磷酸锂（LAP）（TCI发展有限公司，日本）；盐酸（HCl）和氢氧化钠（NaOH）（现代东方（北京）科技发展有限公司，中国）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）（pH=7.4）（北京雷根生物技术有限公司，中国）；兔关节软骨细胞和兔关节软骨细胞完全培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，中国）；Hoechst 33342（北京索莱宝科技有限公司，中国）；Mito-Tracker Deep Red（Invitrogen公司，英国）。

仪器主要包括：Zetasizer粒度电位仪（Nano ZS90，马尔文公司，英国）；飞秒激光器（ErFemto-780 ProH，中国）、振镜（SCANLAB， HurrySCAN14，德国）、压电位移台（PI，P-622.ZCL，德国）；Eclipse Ti-E显微镜和CCD DS-Ri2（尼康，日本）；场发射扫描电子显微镜（FESEM，HITACHI S-4800，日本）；激光扫描共聚焦荧光显微镜（A1 MP，尼康，日本）；酶标仪（Multiskan fc，Thermo scientific，美国）。

2.2　BSA-GMA前驱体溶液的制备

首先，将质量分数0.5%的光引发剂LAP和甲基丙烯酸化度为52%的冻干BSA-GMA粉末以不同浓度溶解在超纯水中，分别形成质量分数20% BSA-GMA（52%）、30% BSA-GMA（52%）和40% BSA-GMA（52%）的前驱体溶液。然后，在超纯水中加入甲基丙烯酸化度为35%和15%的BSA-GMA粉末以及质量分数0.5%的光引发剂LAP，形成质量分数40% BSA-GMA（35%）、40% BSA-GMA（15%）前驱体溶液。图1是前驱体溶液的各组分的分子结构示意图。水凝胶由质量比（R）和甲基丙烯酸化度（D）定义，分别简称为R₂₀D₅₂、R₃₀D₅₂、R₄₀D₅₂、R₄₀D₃₅和R₄₀D₁₅，5种前驱体溶液中各组分的含量如表1所示。前驱体溶液在暗室中充分搅拌1 h，并储存在4 ℃的冰箱中。

图 1. BSA-GMA前驱体溶液各组分的分子结构示意图

Fig. 1. Molecular structures of monomer and photoinitiator for BSA-GMA precursors

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2.3　Zeta电位表征

在不同的pH条件下，使用Zetasizer粒度电位仪对BSA以及改性后不同甲基丙烯酸化度的BSA-GMA的电特性进行了表征。磷酸氢二钠-柠檬酸（Na₂HPO₄-CA）缓冲溶液的pH值分别为4.71、5.30和5.86。将BSA和三种BSA-GMA粉末以质量浓度10 μg·mL^-1溶解在不同pH值的Na₂HPO₄-CA缓冲溶液中，并表征不同样品的Zeta电位值。等电点数值是Zeta电位为0 mV时的pH值，通过跨越0 mV的两个pH值的线性拟合得到。

2.4　宏观BSA-GMA水凝胶的pH响应表征

首先，使用紫外光聚合制备了一系列的宏观BSA-GMA水凝胶圆片，拍照记录水凝胶结构并称重（W₀）。然后，在室温下将200 μL不同pH的溶液滴在含有水凝胶结构的盖玻片上，在装有CCD DS-Ri2和50×物镜（NA为 0.8）的显微镜下记录pH响应过程。pH响应实验分别在pH 2、pH 5、pH 7和pH 11的溶液中进行，其中不同pH的溶液是由浓HCl和NaOH配制。再将水凝胶结构依次浸泡在pH 5、pH 7、pH 2和pH 11的溶液中，达到溶胀平衡后对水凝胶结构拍照记录并称重（W_t）。重复这一过程以获得一系列数据。按照下式，计算不同BSA-GMA水凝胶结构在不同pH溶液中的溶胀百分比（%），以评估BSA-GMA水凝胶的宏观pH响应能力。

2.5　飞秒激光直写制备BSA-GMA 3D水凝胶微结构

飞秒激光直写系统由飞秒激光器、扫描振镜、单轴压电位移台、中性密度滤光片、快门、扩束透镜组、反射镜和计算机等组成。飞秒激光的中心波长为780 nm、脉冲持续时间为150 fs、重复频率为100 MHz。飞秒激光经扩束整形后入射到扫描振镜中，出射的飞秒激光通过4f成像系统后被60×油浸物镜聚焦到移动台上的BSA-GMA前驱体溶液中。机械快门用于控制曝光时间。中性密度滤光片用于调节飞秒激光的功率，以选择合适的功率制造微结构。照明光源的光经待加工样品及物镜后被CCD接收，以实现微纳结构加工过程的实时观察与监测。激光束的扫描路径由振镜控制，然后根据设计图形逐层扫描制作。最后经去离子水显影处理后得到水凝胶微结构。使用S-4800扫描电子显微镜记录BSA-GMA水凝胶微结构的电子显微图像。

2.6　BSA-GMA 3D水凝胶微结构的pH响应表征

首先，利用飞秒激光聚合制备了高为8 μm、直径为3 μm的圆形底座的3D悬浮微结构的BSA-GMA 水凝胶。然后，在室温下分别将200 μL 的pH 2、pH 5、pH 7和pH 11溶液依次滴在含有水凝胶结构的盖玻片上，并在装有CCD DS-Ri2和50×物镜（NA为 0.8）的Eclipse Ti-E显微镜上记录pH响应的明场图像。空气中的结构面积记录为S₀，不同pH溶液中的溶胀面积记录为S_p。微观pH溶胀率的计算公式为

2.7　BSA-GMA 水凝胶结构对细胞活性的影响

首先，利用飞秒激光直写技术制备浓度和取代度最大的R₄₀D₅₂体系的3D细胞支架结构，用体积分数75%的乙醇和紫外线分别灭菌1 h。随后，将兔关节软骨细胞与细胞支架结构在37 °C和体积分数5% CO₂的加湿培养箱中共培养72 h。活细胞线粒体使用Mito-Tracker Deep Red染色20 min，活细胞核使用Hoechst 33342染色10 min。荧光图像使用共聚焦荧光显微镜和20×物镜观察。激发波长分别为405 nm、488 nm和640 nm。

2.8　BSA-GMA浸提液中软骨细胞的增殖

首先，利用紫外光聚合制备BSA-GMA水凝胶圆片，灭菌后在兔关节软骨细胞完全培养基中加入BSA-GMA水凝胶圆片，24 h后得到质量浓度为0.1 g·mL^-1浸提液。然后在96孔板中设置空白组、对照组和测试组来培养细胞，并且各加入100 μL兔关节软骨细胞完全培养基培养一天。空白组无细胞，对照组和测试组每孔加入2500个细胞。随后，将水凝胶浸提液加入测试组（每孔100 μL），而空白组和对照组则在96孔板中继续加入100 μL兔关节软骨细胞完全培养基。培养基每天更换。在1、7和14天时，在每个孔中加入150 μL的CCK-8和培养基的混合溶液（10% CCK-8），孵育2~4 h。随后，使用波长为450 nm的酶标仪测得各孔的吸光度，空白组、对照组和测试组的吸光度分别为A_ODb、A_ODc和A_ODt。相对细胞增长率的计算公式为

3　分析与讨论

3.1　宏观BSA-GMA水凝胶的pH响应

蛋白质由于含有大量的羧酸基团和氨基基团，因此具有随pH响应而改变自身体积的能力^{［9-10， 39］}。BSA水凝胶具有pH响应特性，但为了验证改性是否会对pH响应性产生影响，本研究使用粒度电位仪测量了在不同的pH条件下BSA和甲基丙烯酸化度分别为15%、35%和52%的BSA-GMA样品（简称为D15、D35和D52）的电学性质，并拟合得到等电点数值。如图2（a）所示，随着pH值的增大，BSA、D15、D35和D52样品的Zeta电位值逐渐降低。通过对材料Zeta电位值的线性拟合得到BSA、D15、D35和D52的等电点分别为5.02、5.14、5.15和5.12。结果表明，三种BSA-GMA材料的等电点均略高于BSA，这是因为GMA的接枝引入了羟基消耗了氨基，进而使得等电点增大。BSA-GMA材料的等电点与BSA相当，表明BSA-GMA材料保持了BSA的pH响应特性。

图 2. BSA和不同甲基丙烯酸化度的BSA-GMA（D15、D35和D52）材料的电学性质。（a）BSA和不同甲基丙烯酸化度BSA-GMA材料的Zeta电位；（b）BSA和不同甲基丙烯酸化度的BSA-GMA材料的等电点

Fig. 2. Electrical properties of BSA and BSA-GMA materials with different degrees of methacrylation (D15, D35, and D52). (a) Zeta potentials of BSA and BSA-GMA with different degrees of methacrylation; (b) isoelectric points of BSA and BSA-GMA with different degrees of methacrylation

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利用紫外光聚合制备了一系列的宏观BSA-GMA水凝胶结构，研究了不同单体浓度和甲基丙烯酸化度的宏观BSA-GMA水凝胶结构的pH响应能力（图3）。不同pH条件下，同一个BSA-GMA水凝胶的溶胀情况明显不同。其中R₄₀D₁₅在几种不同pH条件下的变化最为显著，从图3（a）的照片可以看出，在pH 5时溶胀程度最小，在pH 2和pH 11时溶胀变化较大。对于同一pH条件下，不同浓度和甲基丙烯酸化度的BSA-GMA水凝胶中，R₄₀D₁₅的宏观面积变化比其他4种BSA-GMA水凝胶明显。随后，为了量化不同pH条件下，不同浓度和甲基丙烯酸化度的BSA-GMA水凝胶的宏观pH响应情况，对BSA-GMA水凝胶的质量变化进行了统计分析，结果如图3（b）所示。结果表明，在pH 11的溶液中，BSA-GMA水凝胶的溶胀程度最大。由于BSA-GMA材料的等电点为pH 5.1，理论上在pH 5时BSA-GMA的溶胀度应为最小，R₂₀D₅₂、R₃₀D₅₂、R₄₀D₅₂以及R₄₀D₁₅体系水凝胶结构均符合该规律。从pH 5溶液到pH 11溶液，R₂₀D₅₂、R₃₀D₅₂、R₄₀D₅₂、R₄₀D₃₅和R₄₀D₁₅的溶胀率分别为-1.56%、3.19%、9.62%、42.54%和58.53%上升到30.54%、45.57%、39.18%、145.08%和172.57%。与R₂₀D₅₂相比，高浓度的R₄₀D₅₂的溶胀程度略大。在同一浓度下，低甲基丙烯酸化度的R₄₀D₁₅的pH溶胀变化最大。对于不同甲基丙烯酸化度的BSA-GMA，甲基丙烯酸化度越低，溶胀程度越大。因此，通过改变BSA-GMA的浓度和甲基丙烯酸化度可以调节BSA-GMA水凝胶的pH响应程度。

图 3. 不同浓度和甲基丙烯酸化度的BSA-GMA水凝胶的宏观pH响应特性。（a）不同pH溶液中5种BSA-GMA水凝胶的图像；（b）浓度和甲基丙烯酸化度对BSA-GMA水凝胶宏观pH响应的影响

Fig. 3. Macroscopic pH-responsive properties of BSA-GMA hydrogels with different concentrations and degrees of methacrylation. (a) Images of five BSA-GMA hydrogels in different pH solutions; (b) effect of concentration and degree of methacrylation of BSA-GMA hydrogels on the macroscopic pH response

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3.2　飞秒激光直写制备的BSA-GMA3D水凝胶微结构的pH响应

为了进一步研究BSA-GMA材料的微观pH响应性与生物相容性，本研究采用自主搭建的双光子聚合振镜加工系统制备所需要的BSA-GMA 3D水凝胶微结构［图4（a）］。首先，对材料的飞秒激光双光子聚合特性进行研究，以R₄₀D₃₅为代表的光刻胶前驱体在激光功率为19.8 mW、扫描速度为40 μm·s^-1下获得了最小特征尺寸235 nm的聚合线结构。前期BSA-GMA的双光子聚合研究表明，BSA-GMA与自由基I型引发剂发生光聚合的过程不会消耗氨基酸基团^［38］。而BSA只能与自由基II型引发剂发生双光子聚合，会消耗色氨酸、酪氨酸、组氨酸残基或含有酮、酚、胺的氨基酸残基^［40-41］。通过飞秒激光直写聚合的基于BSA-GMA的水凝胶中含有氨基基团与羧基基团［图4（b）］。当暴露于酸性溶液（pH 2）时，由于精氨酸、组氨酸和赖氨酸中的叔胺基团的质子化而带正电。由这些电荷引起的分子链之间的静电排斥扩大了聚合物网格的尺寸，并且额外的水分子的进入导致水凝胶的体积增加并膨胀^［42-43］。当暴露于碱性溶液（pH 11）时，由于天冬氨酸和谷氨酸的羧酸基团的电离而带负电。相反，在pH 5的溶液中时，由于BSA-GMA等电点均在5.1附近，因此BSA-GMA水凝胶不带电，没有静电排斥导致的尺寸增大，只存在水分子进入而导致的体积略微增大。

图 4. 微观pH响应性的BSA-GMA水凝胶微结构的设计与制造示意图。（a）飞秒激光直写系统示意图；（b）微观pH响应的BSA-GMA悬浮结构的响应机制示意图

Fig. 4. Schematic design and fabrication of pH-responsive BSA-GMA hydrogel microstructures. (a) Schematic diagram of the femtosecond laser direct writing system; (b) schematic diagram of the response mechanism of the pH-responsive suspended BSA-GMA structures

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为了评估飞秒激光直写制备的BSA-GMA水凝胶的微观结构的pH响应特性，研究不同pH条件下的可逆膨胀，设计了悬浮式的3D水凝胶微结构，其中，与基板接触的是底部高为8 μm和直径为3 μm的圆柱。以R₂₀D₅₂、R₃₀D₅₂、 R₄₀D₅₂、R₄₀D₃₅与R₄₀D₁₅ 为前驱体制备3D悬浮微结构所采用的加工功率分别为34.8、10.1、9.8、14.9、15.0 mW，扫描速度均为110 μm·s^-1。BSA-GMA水凝胶的悬浮微结构的扫描电镜（SEM）图像如图5（a）所示。除了R₂₀D₅₂体系浓度较低，微观结构与基板有部分黏附外，其他4种BSA-GMA体系的微结构与设计模型相同，底部与基板没有明显的黏附。在空气中，5种BSA-GMA微结构均呈收缩状态，随着pH 5溶液的加入，5种体系均有溶胀变化［图5（b）和（d）］。当加入pH 7的溶液时，5种体系的支架的溶胀出现轻微的溶胀区别，R₄₀D₁₅的溶胀面积最大［图5（e）］。随后，随着pH 2的酸性溶液的加入，BSA-GMA中的氨基质子化，导致水凝胶表现出明显的溶胀变化，R₄₀D₁₅的溶胀程度最大，其次是R₄₀D₃₅ ［图5（c）］。最后，加入碱性溶液，BSA-GMA水凝胶的羧基电离使聚合物链间距扩大，结构的溶胀程度比pH 2时更大［图5（f）］。在其他pH条件下溶胀变化较小的R₂₀D₅₂、R₃₀D₅₂和R₄₀D₅₂三种BSA-GMA体系在pH 11时均可观察到明显的溶胀行为。

图 5. 飞秒激光直写制备的BSA-GMA悬浮水凝胶微结构的pH响应特性。（a）飞秒激光直写制备的BSA-GMA水凝胶悬浮微结构的SEM图；（b）在空气中BSA-GMA悬浮微结构的明场图像；（c）~（f）在不同pH溶液中BSA-GMA悬浮微结构的溶胀行为的明场图像

Fig. 5. pH-responsive properties of suspended BSA-GMA hydrogel microstructures fabricated by femtosecond laser direct writing. (a) SEM images of suspended BSA-GMA hydrogel microstructures fabricated by femtosecond laser direct writing; (b) bright field images of suspended BSA-GMA microstructures in air; (c)‒(f) bright field images of swelling behavior of suspended BSA-GMA microstructures in different pH solutions

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通过量化不同pH条件下的不同BSA-GMA悬浮微结构的溶胀率，研究了单体浓度与甲基丙烯酸化度对水凝胶微结构pH响应的影响［图6（a）］。BSA-GMA微结构在pH溶液中的变化趋势相同，都是在pH 5溶液中溶胀率最小，在pH 11中溶胀率最大。对于同一个pH条件下，浓度越大和甲基丙烯酸化度越小，溶胀程度越大。甲基丙烯酸化度对溶胀的影响大于浓度。在pH 11的溶液中，R₂₀D₅₂到R₄₀D₅₂的溶胀率差值为107.72%，而R₄₀D₅₂到R₄₀D₁₅的溶胀率差值为156.2%。浓度越高导致BSA-GMA微结构中带负电荷的羧基或带正电荷的氨基数量越多，产生的静电斥力越大从而溶胀程度越大。较高的甲基丙烯酸化度导致BSA-GMA水凝胶的交联密度更大，从而阻碍了BSA-GMA微结构的溶胀。BSA-GMA保留了BSA的pH响应特性，pH溶胀程度可以通过甲基丙烯酸化度调节。高浓度和低甲基丙烯酸化度的R₄₀D₁₅在pH 11时溶胀程度最大为333.48%。已报道的研究表明，飞秒激光直写制备的质量分数为40%的BSA水凝胶最大溶胀能达到280%^［9］。以上结果表明，飞秒激光聚合的BSA-GMA不仅具有稳定的3D结构，在pH响应性能上也要优于BSA水凝胶。进一步，通过多次循环溶胀实验验证了制作的水凝胶微结构的可逆性。即使经过15次循环，微结构的响应性也没有明显降低［图6（b）］。

图 6. BSA-GMA悬浮水凝胶微结构的pH响应特性以及循环性能。（a）不同pH溶液中浓度和甲基丙烯酸化度对水凝胶微结构溶胀率的影响；（b）水凝胶微结构的可逆溶胀行为

Fig. 6. pH-responsive and cycling properties of suspended BSA-GMA hydrogel microstructures. (a) Influence of concentration and methacrylation on the swelling degree of the hydrogel microstructures in different pH solutions; (b) reversible swelling behavior of hydrogel microstructures

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3.3　BSA-GMA水凝胶的生物相容性

应用于组织工程或药物递送的生物材料应具有良好的生物相容性^［44］。为了验证BSA-GMA水凝胶在组织工程与药物递送领域的可行性，通过软骨细胞染色的共聚焦荧光图像以及CCK-8实验表征了BSA-GMA水凝胶的生物相容性。使用R₄₀D₅₂的前驱体溶液制备的3D细胞支架的俯视和斜视SEM图像如图7（a）和（b）所示。软骨细胞在细胞支架结构上培养三天后，用Hoechst（λ_ex= 405 nm）和Mito-Tracker Deep Red（λ_ex=640 nm）对活细胞的细胞核和线粒体进行染色。Hoechst单通道的共聚焦荧光图像显示，细胞核在BSA-GMA细胞支架上分布均匀［图7（c）］。BSA具有本征自发荧光（激发/发射波长分别为279 nm/348 nm），这归因于两个色氨酸残基。此外，交联的 BSA 水凝胶在 470 nm 和 595 nm 的激发波长下发出荧光^［45］。波长为488 nm的单通道的共聚焦荧光图像显示，所制备的BSA-GMA水凝胶自发绿色荧光［图7（d）］。Mito-Tracker Deep Red单通道的共聚焦荧光图像显示，细胞在支架上黏附和铺展良好［图7（e）］。共聚焦荧光图像结构表明，软骨细胞在细胞支架上分布均匀，并保持了较高的细胞活性［图7（f）］。

图 7. BSA-GMA 3D水凝胶细胞支架结构及其软骨细胞共培养的共聚焦荧光图像。（a）飞秒激光直写制备的3D细胞支架结构SEM俯视图；（b）飞秒激光直写制备的细胞支架结构SEM斜视图；（c）细胞核（Hoechst）染色的共聚焦荧光图像；（d）细胞支架结构的共聚焦荧光图像；（e）线粒体（Mito-Tracker Deep Red）染色的共聚焦荧光图像；（f）BSA-GMA细胞支架结构上的软骨细胞的共聚焦荧光叠加图像

Fig. 7. BSA-GMA 3D cell scaffold and the confocal fluorescence microscopy images of chondrocytes. (a) SEM top view of the 3D cell scaffold fabricated by femtosecond laser direct writing; (b) SEM oblique view of the 3D cell scaffold fabricated by femtosecond laser direct writing; (c) confocal fluorescence microscopy image of the nucleus (Hoechst); (d) confocal fluorescence microscopy image of the cell scaffold; (e) confocal fluorescence image of the mitochondria (Mito-Tracker Deep Red); (f) overlayed confocal fluorescence image of chondrocytes on BSA- GMA cell scaffolds

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通过CCK-8测试检测了在R₄₀D₅₂水凝胶浸提液中培养的软骨细胞的增殖情况，所采用的激发波长是450 nm。随着细胞与浸提液共培养时间的增长，细胞数量逐渐增加，水凝胶组和对照组细胞的生长趋势相当［图8（a）］。在第1、7和14天，水凝胶组的相对细胞生长率分别为94.53%、90.43%和108.32%［图8（b）］。结果表明，经过GMA修饰后的BSA的生物活性保持良好，BSA-GMA水凝胶无细胞毒性，有利于软骨细胞的存活。BSA-GMA水凝胶可以用在药物释放和组织工程方面的后续应用研究中。

图 8. 利用CCK-8表征的BSA-GMA水凝胶浸提液中软骨细胞的增殖情况。（a）在第1、7和14天对照组和BSA-GMA水凝胶浸提液中培养的软骨细胞的增殖情况；（b）水凝胶浸提液中培养的细胞的相对增长率

Fig. 8. Proliferation of chondrocytes in BSA-GMA hydrogel extract by CCK-8 characterization. (a) Proliferation of chondrocytes cultured in control and BSA-GMA hydrogel extract on 1st, 7th, and 14th days; (b) relative cell growth rate of hydrogel extracts

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4　结论

本工作详细研究了BSA改性后的BSA-GMA 水凝胶的宏观pH响应特性、利用飞秒激光直写的BSA-GMA 3D水凝胶微结构的pH响应特性、pH响应机理以及BSA-GMA水凝胶微结构的生物相容性。BSA与BSA-GMA材料等电点表征结果显示，BSA-GMA材料的等电点与BSA相当，具有pH响应特性。通过飞秒激光直写聚合得到的一系列不同浓度和甲基丙烯酸化度的BSA-GMA 3D悬浮微结构的pH研究表明，BSA-GMA水凝胶具有明显优于BSA水凝胶的3D微结构和pH响应能力。对于同一pH条件下，浓度越大或甲基丙烯酸化度越小，BSA-GMA 3D水凝胶微结构溶胀程度越大。本研究还揭示了BSA-GMA水凝胶在不同pH条件下溶胀程度不同的机理，主要是由于BSA中含有的羧酸基团和氨基基团在不同pH条件下的质子化或电离导致的静电排斥作用。在pH<5时，氨基质子化使BSA-GMA带正电，当pH>5时，羧酸的电离使BSA-GMA带负电荷，氨基酸之间的静电作用产生的排斥力使得聚合物网络扩大。软骨细胞在BSA-GMA支架上的共聚焦荧光图像和相对细胞增长率研究结果表明，BSA-GMA水凝胶具有良好的生物相容性。这种具有可控形态和pH响应特性的蛋白质微结构在组织工程、生物医学和生物传感器领域具有潜在的应用前景。