目的: 从异常核型人胚胎干细胞系中分离两种不同X染色体失活(XCI)状态的细胞, 建立亚系, 并进行对其XCI状态特征和多能性标记进行鉴定。方法: G显带鉴定人胚胎干细胞系chHESC-3早晚期代数细胞的核型, H3K27me3免疫荧光染色鉴定早晚期chHESC-3表观遗传差异, RT-PCR 检测早晚期chHESC-3中XIST基因的表达。利用单细胞克隆的培养分选亚系, H3K27me3、RNA polymeraseⅡ以及DAPI三种标记的共染后每种表观标记各选两株进行RT-PCR, 检测两种亚系中XIST基因的表达。 并对这四株细胞进行干细胞标记鉴定。结果: G显带结果证明早期chHESC-3为正常核型, 晚期代数核型为异常核型, 牵涉到8条染色体的复杂结构变异。H3K27me3免疫荧光染色证明异常核型chHESC-3中有部分细胞出现了H3K27me3凝集点, 而正常核型细胞中未发现。正常核型细胞(chHESC-3N)没有XIST基因表达, 异常核型细胞(chHESC-3C)中有表达。在RNA polymeraseⅡ着色缺口中发现H3K27me3凝集点的细胞亚株XIST基因表达阳性, polymeraseⅡ着色缺口中未发现H3K27me3凝集点的细胞亚株XIST基因表达阴性, XIST阳性和阴性细胞各选两株进行多能性标记免疫荧光染色均为阳性。结论: 成功从异常核型人胚胎干细胞系中分离两种不同XCI状态的细胞并建立亚系, 两种表观类型的亚系均保持多能性标记并能在长期培养中保持各自特性。

目的: 研究比较三种经典饲养层体系使用的成纤维细胞中Wnt基因的表达, 及其对共培养的人胚胎干细胞的影响。方法: PCR验证19种Wnt基因在三种不同来源饲养层细胞中的表达情况, qPCR验证各组共培养人胚胎干细胞的Wnt/β-Catenin信号通路相关基因表达水平, 流式检测其在不同密度饲养层条件下的增殖分化情况。结果: 在全部19种Wnt基因(Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16)的表达检测中, 昆明白小鼠来源饲养层细胞表达其中的16种, ICR小鼠来源饲养层细胞表达其中的10种, 人成纤维细胞来源饲养层细胞表达其中的10种; 增加饲养层细胞密度能够不同程度活化Wnt/β-Catenin信号通路下游基因的表达, 并激活人胚胎干细胞中的负反馈机制; 高密度小鼠饲养层条件促进人胚胎干细胞的分化, 高密度人饲养层条件促进人胚胎干细胞的增殖和分化。结论: 不同经典饲养层体系提供的Wnt环境不同, 其培养的人胚胎干细胞状态也有差异。

在体外受精过程中, 通过胚胎植入前遗传性诊断(PGD)对有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析, 选择无遗传性疾病的胚胎植入子宫, 而PGD诊断异常的胚胎则会被丢弃。本研究尝试将PGD异常胚胎用于分离人胚胎干细胞, 以获得携带遗传缺陷的人胚胎干细胞系。利用荧光原位杂交技术对第3-5天胚胎进行PGD检测, 结果异常的胚胎进一步用于分离获取胚胎干细胞系, 然后对hES细胞系进行核型及干细胞表面标记、多能性基因表达、端粒酶活性以及分化能力等特征性鉴定。总共从13个PGD异常胚胎中分离获得8个人胚胎干细胞系, 建系效率为61.5%, 其中1个核型正常, 5个核型异常。说明利用PGD异常胚胎可以获得携带遗传缺陷的人胚胎干细胞系, 不仅为评估PGD技术临床结论的准确性提供了一种新方法, 更重要的是为研究各种遗传性疾病的发病机理提供了有效的细胞模型。

研究视黄酸(RA)在限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞诱导过程中的最佳作用方式。在无饲养层培养体系下联合多因子分阶段诱导经历10天时间获得胰腺前体细胞。获得的细胞不仅表达胰腺前体细胞的标记pdx1, 但是也同时表达肝脏前体细胞的标记afp。有研究表明在胰腺特化过程中RA能起到抑制afp的作用, 因此在不同的时间点添加RA并持续不同的作用时间来调节内胚层细胞向肝胰分化的命运。收集d7到d10的细胞用免疫组化和RT-PCR检测pdx1和afp的表达情况。结果显示RA从d3开始持续作用到d10可以获得更高的pdx1阳性细胞同时能有效的抑制afp的表达, 并且在d9可以获得最高比率的pdx1阳性细胞, 提示RA持续作用促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化。

小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有两种不同的多能性状态-原始态多能性(naive pluripotency)和始发态多能性(primed pluripotency), 这两种多能性干细胞在形态、自我更新维持条件、基因表达、表观遗传学特征以及单克隆形成率等方面都存在明显差别。传统条件下分离和培养的人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells, hESCs)生物学特征更接近始发态多能性状态, 需依赖转基因操作才能获得和维持原始态多能性状态。本研究通过在培养体系中添加化学小分子成功地将已建系的始发态多能性hESCs转化为原始态多能性干细胞, 转化后hESCs呈紧密、圆形、隆起的三维克隆结构, 具有两条活化的X染色体, 单克隆形成率提高, 基因表达更接近原始态多能性特征。结果提示hESCs也存在两种多能性状态, 不同的体外培养环境可获得具备不同多能性特征的hESCs。原始态多能性状态的获得使hESCs在基因治疗、器官再生等领域具有广阔的应用前景, 而仅改变培养条件, 不依赖基因操作的培养方式大大提高了原始态多能性干细胞应用的安全性。

研究不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力是否存在差异, 并尝试寻找造成差异的原因。基于已建立的人胚胎干细胞库资源和限定性内胚层定向诱导分化体系, 流式检测诱导分化3天后10株细胞系Sox17的阳性比率发现其值在60%到80%之间波动, 而SSEA4的阳性比率在人胚胎干细胞系中不存在明显差异。基因表达谱结果显示像Sox17, Foxa2等内胚层标记在这些细胞之间不存在显著的差异, 而像MEG3和SNORD114-3在差异细胞系之间和同株细胞早晚期代数之间存在表达差异。结果提示不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力存在着差异, 推测这些差异可能与MEG3和SNORD114-3的差异表达相关。

目的: 研究Borealin及CPC(Chromosomal Passenger Complex)相关基因表达变化与胚胎干细胞瘤变过程的关系, 从而了解Borealin在干细胞中的特殊功能。方法: 培养不同状态的胚胎干细胞及畸胎癌细胞, 并提取总RNA, 进行芯片和荧光定量PCR分析。结果: ES (embryonic stem cell)细胞分化过程中Borealin基因表达下调; 在ES细胞染色体发生变异的过程中部分染色体复合物相关基因的表达发生了明显的变化, EC(embryonic cancer cell)细胞中Borealin、Survivin, MCAK、Aurora B、Op18等基因的表达明显高于正常胚胎干细胞。结论: Borealin及CPC异常的表达可能是胚胎干细胞瘤变的一个重要标记。

卵泡液是在卵泡形成过程中生成的, 作为卵母细胞生长和分化的培养基, 直接或间接影响卵母细胞的生育力和发育潜能, 其成分非常复杂。本研究通过调整, 优化2-DE技术条件, 建立了相对稳定的卵泡液蛋白质2-DE技术, 获得了卵泡液蛋白质组表达图谱, 并用PDQuest软件进行了图像分析, 用MALDI-TOF MS鉴定了9个蛋白点, 其中有四种为新鉴定的在卵泡液中表达的蛋白质。结果表明, 该体系稳定性、重复性好, 为进一步开展卵泡液蛋白质组学的相关研究奠定了基础。

目的: 应用定量荧光原位杂交(Q-FISH)方法测定端粒长度。方法: 选取4种端粒长度均一的标准细胞株采用Q-FISH的方法做出荧光亮度与端粒长度的标准曲线, 从而得出实验细胞株的端粒长度, 与DNA印迹法测定末端限制性片段(TRF)长度进行二者之间的相关性分析。结果: 检测荧光强度的最佳线性曝光时间为400 ms, 相对于DNA印迹法, 定量荧光原位杂交(Q-FISH)法所需标本量少, 实验周期短, 端粒长度结果与Southern杂交法具有很好的相关性。结论: 采用定量荧光原位杂交方法测端粒长度具有重复性好、精确可靠的特点, 适用于对珍贵标本的端粒改变进行分析。

目的: 探讨人类胚胎在早期发育过程中端粒维持的机制。 方法: 利用端粒特异性探针对临床IVF过程中2~8细胞时期停止发育不适合移植的胚胎和来自于囊胚期的人类胚胎干细胞进行荧光原位杂交检测端粒重组。结果: 人类早期胚胎发育中存在端粒交换的结构APB小体, 而来自于囊胚期的胚胎干细胞不再具有这种结构, 胚胎干细胞端粒交换发生频率较低(0.15 %)。 结论: 结合其他实验报道, 提示人类胚胎早期发育过程中出现两种端粒维持机制的并存。