急性早幼粒细胞白血病(APL)属于急性髓系白血病（AML）, 是FAB分型中的M3亚型。 部分APL患者形成早幼粒细胞白血病/维甲酸受体融合基因, 即PML-RARα融合基因。 在内外界多种因素的共同作用下, 早幼粒细胞白血病发病。 胚胎干细胞(ESCs)具有多向分化的能力, 在一定诱导条件下, ESCs可以向造血系统分化。 早幼粒细胞位于ESCs分化下游, 为粒系分化阶段的一种细胞。 探索一种非标记的技术方法鉴别不同分化阶段造血细胞具有重要的科研和实践意义。 拉曼光谱技术可用于多种类型疾病的鉴别诊断研究, 近年来应用前景愈加广阔。 实验研究人胚胎干细胞系（ES）、 急性早幼粒细胞白血病细胞系（NB4）和急性早幼粒细胞白血病患者（M3）白血病细胞的拉曼光谱特征, 建立拉曼光谱非标记鉴别不同分化阶段白血病的方法, 为临床实验研究提供基础。 分别收集胚胎干细胞系（ES）、 急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和4例M3患者白血病细胞, 使用Horiba Xplora拉曼光谱仪获取拉曼光谱, 每组或每例患者采集25～30个白血病细胞光谱。 结合应用主成分分析法(PCA)、 判别函数分析(DFA)、 系统聚类分析和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）, 对三类细胞的光谱进行分析并建立模型, 进而对三类细胞进行鉴别, 应用交互验证法对模型进行验证。 同时结合细胞超微结构分析三种细胞的拉曼光谱特征。 M3, NB4和ES细胞的拉曼光谱差别显著, 主要表现为M3和NB4细胞光谱中对应核酸、 蛋白质及脂类物质的谱峰明显高于ES细胞, 其生物学机制包含了APL与PI3K/Akt/mTOR通路的密切关系。 PI3K/Akt/mTOR通路在急性早幼粒细胞白血病细胞中存在异常激活, 影响白血病细胞的生物大分子代谢； 鉴别建模的总体分类准确率达100%(181/181), 交互验证的分类准确率达98.9%(179/181), 表明鉴别模型预测能力良好。 拉曼光谱分析显示M3细胞和NB4细胞增殖代谢明显高于ES细胞, 根据PCA-DFA、 聚类分析及PLS-DA建立的拉曼光谱鉴别模型能够准确区分3种不同分化阶段白血病相关细胞, 其结果与电镜结果相符。

目的: 从异常核型人胚胎干细胞系中分离两种不同X染色体失活(XCI)状态的细胞, 建立亚系, 并进行对其XCI状态特征和多能性标记进行鉴定。方法: G显带鉴定人胚胎干细胞系chHESC-3早晚期代数细胞的核型, H3K27me3免疫荧光染色鉴定早晚期chHESC-3表观遗传差异, RT-PCR 检测早晚期chHESC-3中XIST基因的表达。利用单细胞克隆的培养分选亚系, H3K27me3、RNA polymeraseⅡ以及DAPI三种标记的共染后每种表观标记各选两株进行RT-PCR, 检测两种亚系中XIST基因的表达。 并对这四株细胞进行干细胞标记鉴定。结果: G显带结果证明早期chHESC-3为正常核型, 晚期代数核型为异常核型, 牵涉到8条染色体的复杂结构变异。H3K27me3免疫荧光染色证明异常核型chHESC-3中有部分细胞出现了H3K27me3凝集点, 而正常核型细胞中未发现。正常核型细胞(chHESC-3N)没有XIST基因表达, 异常核型细胞(chHESC-3C)中有表达。在RNA polymeraseⅡ着色缺口中发现H3K27me3凝集点的细胞亚株XIST基因表达阳性, polymeraseⅡ着色缺口中未发现H3K27me3凝集点的细胞亚株XIST基因表达阴性, XIST阳性和阴性细胞各选两株进行多能性标记免疫荧光染色均为阳性。结论: 成功从异常核型人胚胎干细胞系中分离两种不同XCI状态的细胞并建立亚系, 两种表观类型的亚系均保持多能性标记并能在长期培养中保持各自特性。

目的: 研究比较三种经典饲养层体系使用的成纤维细胞中Wnt基因的表达, 及其对共培养的人胚胎干细胞的影响。方法: PCR验证19种Wnt基因在三种不同来源饲养层细胞中的表达情况, qPCR验证各组共培养人胚胎干细胞的Wnt/β-Catenin信号通路相关基因表达水平, 流式检测其在不同密度饲养层条件下的增殖分化情况。结果: 在全部19种Wnt基因(Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16)的表达检测中, 昆明白小鼠来源饲养层细胞表达其中的16种, ICR小鼠来源饲养层细胞表达其中的10种, 人成纤维细胞来源饲养层细胞表达其中的10种; 增加饲养层细胞密度能够不同程度活化Wnt/β-Catenin信号通路下游基因的表达, 并激活人胚胎干细胞中的负反馈机制; 高密度小鼠饲养层条件促进人胚胎干细胞的分化, 高密度人饲养层条件促进人胚胎干细胞的增殖和分化。结论: 不同经典饲养层体系提供的Wnt环境不同, 其培养的人胚胎干细胞状态也有差异。

在体外受精过程中, 通过胚胎植入前遗传性诊断(PGD)对有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析, 选择无遗传性疾病的胚胎植入子宫, 而PGD诊断异常的胚胎则会被丢弃。本研究尝试将PGD异常胚胎用于分离人胚胎干细胞, 以获得携带遗传缺陷的人胚胎干细胞系。利用荧光原位杂交技术对第3-5天胚胎进行PGD检测, 结果异常的胚胎进一步用于分离获取胚胎干细胞系, 然后对hES细胞系进行核型及干细胞表面标记、多能性基因表达、端粒酶活性以及分化能力等特征性鉴定。总共从13个PGD异常胚胎中分离获得8个人胚胎干细胞系, 建系效率为61.5%, 其中1个核型正常, 5个核型异常。说明利用PGD异常胚胎可以获得携带遗传缺陷的人胚胎干细胞系, 不仅为评估PGD技术临床结论的准确性提供了一种新方法, 更重要的是为研究各种遗传性疾病的发病机理提供了有效的细胞模型。

研究视黄酸(RA)在限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞诱导过程中的最佳作用方式。在无饲养层培养体系下联合多因子分阶段诱导经历10天时间获得胰腺前体细胞。获得的细胞不仅表达胰腺前体细胞的标记pdx1, 但是也同时表达肝脏前体细胞的标记afp。有研究表明在胰腺特化过程中RA能起到抑制afp的作用, 因此在不同的时间点添加RA并持续不同的作用时间来调节内胚层细胞向肝胰分化的命运。收集d7到d10的细胞用免疫组化和RT-PCR检测pdx1和afp的表达情况。结果显示RA从d3开始持续作用到d10可以获得更高的pdx1阳性细胞同时能有效的抑制afp的表达, 并且在d9可以获得最高比率的pdx1阳性细胞, 提示RA持续作用促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化。

小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有两种不同的多能性状态-原始态多能性(naive pluripotency)和始发态多能性(primed pluripotency), 这两种多能性干细胞在形态、自我更新维持条件、基因表达、表观遗传学特征以及单克隆形成率等方面都存在明显差别。传统条件下分离和培养的人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells, hESCs)生物学特征更接近始发态多能性状态, 需依赖转基因操作才能获得和维持原始态多能性状态。本研究通过在培养体系中添加化学小分子成功地将已建系的始发态多能性hESCs转化为原始态多能性干细胞, 转化后hESCs呈紧密、圆形、隆起的三维克隆结构, 具有两条活化的X染色体, 单克隆形成率提高, 基因表达更接近原始态多能性特征。结果提示hESCs也存在两种多能性状态, 不同的体外培养环境可获得具备不同多能性特征的hESCs。原始态多能性状态的获得使hESCs在基因治疗、器官再生等领域具有广阔的应用前景, 而仅改变培养条件, 不依赖基因操作的培养方式大大提高了原始态多能性干细胞应用的安全性。

研究不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力是否存在差异, 并尝试寻找造成差异的原因。基于已建立的人胚胎干细胞库资源和限定性内胚层定向诱导分化体系, 流式检测诱导分化3天后10株细胞系Sox17的阳性比率发现其值在60%到80%之间波动, 而SSEA4的阳性比率在人胚胎干细胞系中不存在明显差异。基因表达谱结果显示像Sox17, Foxa2等内胚层标记在这些细胞之间不存在显著的差异, 而像MEG3和SNORD114-3在差异细胞系之间和同株细胞早晚期代数之间存在表达差异。结果提示不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力存在着差异, 推测这些差异可能与MEG3和SNORD114-3的差异表达相关。

目的: 研究Borealin及CPC(Chromosomal Passenger Complex)相关基因表达变化与胚胎干细胞瘤变过程的关系, 从而了解Borealin在干细胞中的特殊功能。方法: 培养不同状态的胚胎干细胞及畸胎癌细胞, 并提取总RNA, 进行芯片和荧光定量PCR分析。结果: ES (embryonic stem cell)细胞分化过程中Borealin基因表达下调; 在ES细胞染色体发生变异的过程中部分染色体复合物相关基因的表达发生了明显的变化, EC(embryonic cancer cell)细胞中Borealin、Survivin, MCAK、Aurora B、Op18等基因的表达明显高于正常胚胎干细胞。结论: Borealin及CPC异常的表达可能是胚胎干细胞瘤变的一个重要标记。

目的: 探讨人类胚胎在早期发育过程中端粒维持的机制。 方法: 利用端粒特异性探针对临床IVF过程中2~8细胞时期停止发育不适合移植的胚胎和来自于囊胚期的人类胚胎干细胞进行荧光原位杂交检测端粒重组。结果: 人类早期胚胎发育中存在端粒交换的结构APB小体, 而来自于囊胚期的胚胎干细胞不再具有这种结构, 胚胎干细胞端粒交换发生频率较低(0.15 %)。 结论: 结合其他实验报道, 提示人类胚胎早期发育过程中出现两种端粒维持机制的并存。

目的: 分析在人类胚胎干细胞分化过程中, CDCA8基因启动子区甲基化的状态。方法: 生物信息学预测人类CDCA8基因上游2 kb区域的CpG岛。抽提未分化和自然分化的人类胚胎干细胞gDNA, 应用重亚硫酸盐修饰和DNA序列分析方法检测CDCA8基因启动子区CpG岛甲基化情况。结果: 未分化和自然分化的人类胚胎干细胞中, 被检测的CDCA8基因启动子区CpG岛均未发现明显的甲基化修饰。结论: 在人类胚胎干细胞分化前后, CDCA8基因启动子关键区域的甲基化状态未发生明显改变。