研究高通量微流控荧光定量聚合酶链反应(PCR)激发光非均匀性问题对提高DNA浓度 定量结果的精度具有重要意义。 根据荧光定量PCR的原理,分析了激发光非均匀性对循环阈值(Ct)测量精度的影响,给出了激发光非均 匀性引起Ct值测量偏差的表达式,确定了激发光强度标准偏差应小于11.56%的要求。根据微流控芯片结 构特点及激发光均匀性要求,设计了基于光棒的匀光光路用于解决激发光照度非均匀性问题。模拟及实 验所得到的激发光照度的相对标准偏差分别为3.10%、6.01%,二者均小于11.56%。所设计匀光光路能够 满足高通量微流控荧光定量PCR的要求。

微流控荧光PCR产物在高分辨率熔解(HRM)曲线分析的过程中,随着DNA的解链荧光强度发生突变,而能否检测到该突变点则依赖于温控的精度。提 出了多阈值PID算法,设计了一种适用于高分辨率熔解曲线分析的FPGA温度控制系统。根据测得温度值与设定值之间的差异,改变FPGA电路系 统输出的脉冲宽度调制(pulse width modulation, PWM)波占空比和算法的调节频率实现对温度的准确控制。经过温度标定后,系统温度控制精度优于0.1℃,分辨率达到±0.01℃。HRM分析 实验结果表明,本方法成功地辨别出了DNA序列的单碱基差异,温度控制系统达到了设计的要求。

综合参考标样法和定标校正法的思想,提出了一种用于校正微流控实时荧光聚合酶链式反应(PCR)系统荧光成像非均匀性的"多目标像素区域定标线性校正"算法, 以提高其检测结果的准确性。以与PCR荧光标记物SYBR Green光谱特性相似的荧光素钠溶液为样本, 检测了11种不同浓度的均匀荧光素钠溶液受激发射荧光信号的强度, 分析了各个目标像素区域荧光强度和荧光素钠溶液浓度之间的线性响应关系, 采用两点定标校正方法计算了CCD各个目标像素区域的校正系数矩阵。实验表明, 3种浓度荧光素钠溶液的成像均匀度分别从校正前的71.28%、72.01%、70.73%提高到校正后的77.49%、80.07%、90.64%; 微流控四腔芯片中相同浓度的DNA样品在PCR扩增阶段的Ct值相对标准偏差由校正前的4.38%、1.94%、3.31%减小到校正后的2.44%、0.79%、1.31%, 显著提高了微流控实时荧光PCR检测结果的准确性。

中国科学院“计划”和合肥工业大学博士基金(GDBJ2008043)资助课题。