本研究利用Red/ET DNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰, 将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子, 成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB, pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB, 并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达, 通过LB培养基发酵42 h后, Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17.56 mg/L, 而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB, Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11.135 mg/L, 441.135 mg/L, 557.764 mg/L, 启动子优化后产量分别是原始启动子的0.63, 25.12和31.76倍。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析, 共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量, 发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhlAB基因表达量分别是原始启动子的2.16和2.77倍。本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达, 发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高, 可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考。

对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆, 构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体, 实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达, 并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性。利用 Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB; 再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB, 将这两个表达载体分别电转至Pf-5中, 通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子, 以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活, 并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响。本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931.1 and AJK49932.1); 成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB, 并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性; 以LB培养基培养至24 h时, 启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2.1倍; 在LB培养基摇瓶发酵至66 h时, Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13.51 U/mL, 而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46.85 U/mL, 是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3.47倍。初步实现基因lipA在Pf-5中的表达, 发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高, 为将来实现规模化生产奠定了技术基础。