利用宽带飞秒振荡器作为激发光源搭建了双光子荧光显微成像系统, 在飞秒脉冲的宽带激发下, 测量了罗丹明B溶液的双光子荧光光谱, 开展了罗丹明B固体样品的双光子荧光显微成像研究。在双光子荧光显微成像研究中, 通过调节激发脉冲的功率, 分析了双光子荧光强度和激发脉冲功率之间的关系, 并且利用半波片改变线偏振激发光场的偏振方向, 研究了双光子荧光强度随激发脉冲偏振方向的变化趋势, 实现了双光子荧光强度的类正弦调制。

Apoptosis is very important for the maintenance of cellular homeostasis and is closely related to the occurrence and treatment of many diseases. Mitochondria in cells play a crucial role in programmed cell death and redox processes. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD(P)H) is the primary producer of energy in mitochondria, changing NAD(P)H can directly reflect the physiological state of mitochondria. Therefore, NAD(P)H can be used to evaluate metabolic response. In this paper, we propose a noninvasive detection method that uses two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (TP-FLIM) to characterize apoptosis by observing the binding kinetics of cellular endogenous NAD(P)H. The result shows that the average fluorescence lifetime of NAD(P)H and the fluorescence lifetime of protein-bound NAD(P)H will be affected by the changing pH, serum content, and oxygen concentration in the cell culture environment, and by the treatment with reagents such as H2O2 and paclitaxel. Taxol (PTX). This noninvasive detection method realized the dynamic detection of cellular endogenous substances and the assessment of apoptosis.

相对于近红外波段的飞秒激光脉冲, 紫外波段的飞秒脉冲由于具有单光子能量高、聚焦特性好、电离率高和成丝阈值低等优点, 在高功率密度光场的产生、等离子体光物理等领域有着越来越广阔的应用前景, 成为激光技术的研究热点。随着紫外飞秒激光技术的发展, 传统的脉宽测量方法不能满足需求。指出了紫外飞秒激光脉宽测量研究的主要进展, 讨论了目前可用于紫外飞秒激光脉宽的测量方法, 主要有双光子荧光测量法、互相关法、简并四波混频法、多光子电离法, 介绍了相关测量原理与特点。在此基础上, 对紫外飞秒激光脉宽测量技术研究前景进行了展望。

内窥镜物镜是双光子成像应用于医疗内窥成像的关键部件，物镜的成像质量和信号光收集效率对最终图像的质量至关重要。为光纤扫描式双光子成像系统设计了一款高收集效率、大视场、结构紧凑的物镜。在该系统中，920 nm飞秒激光从双包层光纤纤芯部分出射，经过物镜后激发样本，激发出的460 nm二次谐波和510 nm荧光再次经过物镜后被收集到光纤包层中。在此过程中，为了提高荧光的收集效率，对物镜组进行轴向色差设计，以使更多的荧光进入光纤包层部分。利用Zemax光学设计软件进行系统优化设计，设计结果表明：物镜组在920 nm波长下全视场范围内的调制传递函数在700 lp/mm处大于0.25，满足激发光的使用要求；在Zemax软件非序列模式下,将设计的物镜和传统梯度折射率物镜的信号光收集效率进行比较，仿真结果显示，所设计的物镜的信号光收集效率高达54%，比传统梯度折射率物镜提高了2倍以上。

设计合成了一种A-π-D-π-A型的双光子荧光染料3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑, 测试了其在二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈(ACN)、二甲亚砜(DMSO)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)等不同溶剂中的紫外吸收光谱、单光子及双光子荧光光谱。化合物3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑在紫外吸收光谱中存在两个相似的特征吸收带并呈现出复杂的溶剂化效应, 在DMSO中具有最大荧光量子产率(86.02%), 其相应的活性吸收截面为12.56 GM。在双光子荧光成像方面, 染料分子具有优良的细胞膜通透性并且在双光子荧光显微镜下呈现出明亮的绿色荧光, 表现出较好的双光子荧光成像性能。这些数据表明, 化合物3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑可用作一种较为理想的双光子荧光标记染料。

双光子荧光显微成像是一种非线性光学显微技术，具有高空间分辨率、高信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点。传统的双光子荧光显微成像通常使用波长可调谐的100 fs超短脉冲激光器作为激光光源。目前，人们对双光子荧光显微成像方法进行了深入研究，改进光源及探测方法是常用的手段。介绍和总结了多色双光子荧光显微成像技术的近期研究进展及其在生物医学中的应用。首先介绍了传统飞秒激光器及光学参量振荡器在多色成像中的应用，然后对光纤超连续谱在多色显微成像中的应用进行了分析，最后简要说明了增强自相位调制效应产生连续光谱以及选择性激发实现多色成像的工作。多色双光子成像技术不仅可以同时获取含有多种荧光团的待测样品的高对比度双光子荧光图像，而且具有系统结构简单、操作简便等优点，这使得其在生物医学和材料科学等领域具有广阔的应用前景，并且为生物医学诊断与研究提供了一种有效的工具和平台。

在飞秒激光随机扫描双光子显微成像系统中使用宽带二维声光偏转器扫描飞秒激光, 可以增大扫描角度至74 mrad, 增大双光子显微成像范围。但宽带二维声光偏转器在大角度扫描时引入的色散较大, 造成成像范围边缘的光斑严重畸变, 边缘光斑直径达2.3 μm, 影响边缘视场的成像质量。为了提高成像质量, 设计了一种新的色散补偿方法, 基于衍射透镜组成的开普勒望远系统, 可以同时补偿不同扫描角度的不同色散。经过色散补偿后成像边缘的光斑直径小于1 μm, 使系统获得大范围扫描成像的同时, 所有扫描角度的色散都能够得到很好的补偿, 在整个视场范围内光斑直径小于1 μm, 实现更均匀的荧光激发, 均匀成像。

为解决双光子荧光显微成像系统轴向扫描问题, 提出一种基于数字微镜(DMD)的快速轴向扫描系统。该系统采用DMD选择光路, 不同光路放置不同焦距的透镜组对光束发散角产生不同的改变, 经物镜聚焦后得到不同深度的轴上扫描点。对该系统的轴向扫描距离、扫描点位置及衍射效率进行了理论计算仿真, 结果表明: 扫描系统采用4个模块以及5个模块时其轴向扫描距离均可达到1 mm, 4模块系统中透镜的焦距为297.3 mm, 5模块系统中透镜焦距为361.47 mm。轴向扫描点除边缘点外线性分布,轴向扫描频率达到几十kHz, 满足脑神经成像的要求。