熔融石英光学元件的亚表面缺陷直接影响着其成像质量及激光损伤阈值等指标。相比缺陷的二维截面大小以及深度信息,亚表面缺陷三维轮廓及缺陷体积的定量检测结果可以用来更准确地评估熔融石英光学元件的加工质量。结合共聚焦显微镜的成像原理,使用共聚焦显微镜进行了熔融石英样品层析扫描实验。通过对亚表面缺陷图像特点的分析,提出了适用熔融石英元件亚表面缺陷的三维重建算法。提出的算法在亚表面缺陷重建效率与精度上均优于其他三维重建方法。根据重建后缺陷的统计结果,定量获得了熔融石英样品亚表面缺陷的完整三维信息。

本文以华中农业大学园艺植物教育部重点实验室细胞生物学实验平台现有的一套由德国徕卡公司生产的新型号TCS-SP8激光共聚焦扫描显微镜机组(文中简称SP8)为例, 结合实际操作经验, 从机组组成使用、软件的使用、使用中常见问题、用后维护及保养等方面进行了大量总结和探索, 希望能够为初次使用仪器者及致力于该领域的科研工作者提供第一手直观详实易懂的操作规程。

分析和比对钙结合蛋白CIB1在人类、大鼠、小鼠中氨基酸序列差异, 并研究CIB1蛋白在293T细胞中的表达及亚细胞定位情况。通过Western Blot分析发现293T细胞本身几乎检测不到CIB1的表达。进一步采用CIB1外源性质粒转染, 通过免疫荧光分析实验, 在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间293T细胞中CIB1的表达情况及亚细胞定位变化。实验结果表明, 随着转染时间的增加, CIB1在293T细胞中的表达有逐渐增强的趋势, 并且发生从细胞核向细胞质的转位现象。该实验结果对了解CIB1亚细胞定位变化及功能研究具有重要参考价值。

柑橘溃疡病对柑橘产业造成了巨大损失, 而研究柑橘与溃疡病菌的互作关系以及柑橘的感病和抗病性均需要观察溃疡病菌在柑橘寄主中的侵染和定殖过程。激光共聚焦扫描显微镜不仅可以观察活细胞, 活组织的动态代谢过程, 而且可以获得三维图像, 对于病原菌在柑橘植物组织内的繁殖和致病机制研究具有重要意义。但是, 选择适宜的植物材料和制片方法对激光共聚焦扫描显微镜的观察效果影响很大。本文对激光共聚焦扫描显微镜所观察的材料在其处理和观察方法上加以改进, 获得了质量更好的图片和实验结果, 也使得实验更为方便快捷。激光共聚焦扫描显微观察还在瞬时表达分析中得到应用, 提高了柑橘瞬时表达分析的效果。通过将切片和压片相结合观察到溃疡病菌在不同时间点对柑橘叶片的侵染情况, 而通过3D建模能观察到柑橘叶片不同组织层面中的病菌数量和病菌位置, 为研究溃疡病菌在叶片中的定殖方式和入侵数量提供了前期基础。

为研究动脉粥样硬化中单核细胞膜流动性的变化, 本实验选用20只新西兰白兔建立动物粥样硬化模型, 提取模型组与对照组兔外周血中单核细胞, 通过荧光漂白恢复技术检测单核细胞膜流动性, 并结合动脉粥样硬化动物模型病理切片揭示其与动脉粥样硬化相关性。结果显示动物动脉粥样硬化模型建立成功, 模型组单核细胞膜的荧光恢复率和扩散系数均低于对照组。本研究揭示了单核细胞细胞膜的流动性与动脉粥样硬化的发生有关, 为今后深入探究单核细胞与动脉粥样硬化关系提供实验基础。

利用点扩散函数(PSF)研究了入射激光的偏振态和光束的束腰直径对激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)分辨率的影响。根据Wolf和Richards的矢量衍射积分，建立了LSCM N-1层界面下的照明PSF模型，对零层和两层界面下的PSF进行了计算分析。结果显示: 在零层界面下，圆偏振光入射的PSF在xy平面内关于焦点旋转对称，半峰全宽为043 μm,x向线偏振光入射时PSF在x、y方向的半峰全宽分别为048, 039 μm; 在圆偏振光入射的PSF中，高斯光束充溢系数为0，1，2，5对应的半峰全宽分别为043，047，062，149 μm。在两层界面下，当探测深度为50 μm时，圆偏振光PSF的半峰全宽为026 μm，x向线偏振光入射时PSF在x、y方向的半峰全宽分别为028，024 μm; 在圆偏振光入射的PSF中，充溢系数为0，1，2，5对应的半峰全宽分别为026，028，032，068 μm。以上计算结果表明，和线偏振光相比，圆偏振光在一个方向的分辨率优于线偏振光，在相垂直的另一个方向的分辨率弱于线偏振光，圆偏振光PSF在xy平面内关于焦点旋转对称，得到了较好的成像质量; 物镜入瞳直径与激光束腰直径比值越小，LSCM的分辨率越好。

目的: 探讨细菌外排泵抑制剂(microbial efflux pump Inhibitor, EPI) ——维拉帕米对以甲苯胺蓝O(toluidine blue O, TBO)为光敏剂的光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)抑制牙菌斑生物膜内主要致龋菌作用的影响。方法: 以变形链球菌、血链球菌、嗜酸性乳杆菌和粘性放线菌为实验菌株, 建立牙菌斑生物膜模型。以维拉帕米作为细菌外排泵抑制剂, 根据在PDT过程中加入维拉帕米和光敏剂的先后顺序, 实验分为5 组。A组: 生理盐水处理组。B组: 单纯PDT处理组。C组: 同时加入光敏剂和维拉帕米PDT处理组。D组: 先加入维拉帕米后加入光敏剂PDT处理组。E组: 先加入光敏剂后加入维拉帕米PDT处理组。平板菌落计数观察牙菌斑生物膜活性, 并运用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy, CLSM)对处理后的牙菌斑生物膜进行断层扫描、分析。结果: 与生理盐水处理组相比, 单纯PDT处理组牙菌斑内致龋菌存活的数量( CFU/mL)明显减少(P＜0.05),其抑菌率为81.02%; 与单纯PDT处理组相比, 加入维拉帕米的PDT处理组内牙菌斑内致龋菌存活数量有下降趋势。其中先加入维拉帕米后加入光敏剂PDT处理组牙菌斑内致龋菌存活数量显著性下降(P＜0.05), 抑菌率高达93.60%; 激光共聚焦显微镜观察发现菌斑生物膜发生明显的变化。结论: 实验表明光动力疗法有明显的防龋效果, 且细菌外排泵抑制剂对PDT防龋效果有促进作用。

研究受脉冲磁场处理金黄色葡萄球菌(S.aureus)细胞Ca2+的跨膜行为, 为此研究了表征S.aureus胞内Ca2+浓度变化Fura-2/AM荧光探针检测法, 并检测了不同脉冲数下经脉冲磁场处理后S.aureus细胞荧光强度的变化, 采用激光共聚焦扫描显微镜(LCSM)观察了经脉冲磁场处理前后S.aureus胞内Ca2+浓度的变化。 研究结果表明, Fura-2/AM可成功的负载于S.aureus中, 可以应用于S.aureus胞内游离钙离子浓度变化的测定。 经脉冲磁场处理后, S.aureus胞内钙离子浓度显著上升, 且与活菌数的减少高度相关, 相关度达到－0.989 15； 胞内光点显著增多, 光点荧光强度明显增大, 说明大量胞外钙离子跨膜进入胞内。 因此, 可以判断微生物细胞膜通透性的改变和胞内Ca2+浓度的上升是高强度脉冲磁场具有杀菌作用的重要原因。

目的: 研究胞外不同浓度的镁离子对SD成年大鼠心肌细胞钙瞬变的影响。方法: 采用激光共聚焦显微镜系统同步配合阈上电刺激探测心肌细胞钙瞬变。结果: 胞外低浓度的镁离子(0 mmol/L、0.5 mmol/L, 正常镁离子浓度为1 mmol/L) 可以升高钙瞬变的峰值(P<0.05), 但不影响钙瞬变的持续时间(以钙瞬变的半高宽表示) (P>0.05) ; 胞外高浓度的镁离子(2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L) 均可抑制钙瞬变的峰值(P<0.05) ; 其中5 mmol/L和10 mmol/L的胞外镁还能延长钙瞬变的持续时间(P<0.05) 。结论: 正常情况下镁对心肌细胞钙瞬变有抑制作用。

采用10.08 kJ/m2.d辐射剂量的UV-B辐照处理“晋麦8号”冬小麦种子, 待根尖生长至1 cm～2cm长时, 对小麦根尖细胞的有丝分裂率以及各类异常分裂现象进行了研究, 并进一步探讨了产生异常分裂的细胞生物学机理。结果表明: 增强的UV-B辐照能抑制小麦细胞有丝分裂的发生频率, 并可诱导小麦根尖细胞产生游离染色体、落后染色体、染色体桥(包括单桥、双桥和三桥染色体)、不均等分裂以及微核染色体等畸变现象。另外, 在增强UV-B辐射处理后的细胞中还深入研究了新型的异常分裂现象-分束分裂, 表现为染色体在细胞有丝分裂后期产生三束、四束、六束和七束等染色体束, 且均具有一定的发生频率, 分别为0.073 %、0.153 %、0.053 %和0.060 %。而在对照组小麦细胞中没有发现分束分裂现象的发生。同时, 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和激光共聚焦扫描显微镜观察发现, 与CK组相比, 分束分裂细胞中, 微管蛋白的组成和微管骨架的形态结构均发生了变化。因此, 推测分束分裂现象的发生可能与增强UV-B辐射导致细胞骨架微管系统损伤有关。