1 引言

表面增强拉曼散射(SERS)可用于表征分子振动的信息^[1-2],是利用金属或金属纳米颗粒作为检测基底的一种分析测试技术,而金属或金属纳米颗粒的表面粗糙度则决定了是否能够增强探针分子的信号。这种技术能够细致地反映出生物中的蛋白质和脂类物质等一些有机复杂大分子以及核酸的结构信息^[3-4],因此可以利用SERS技术来提高生物测量系统的拉曼信号,在一定条件下可以提高几个数量级,并能有效减弱荧光背景,因此在生物系统的强荧光背景检测中非常适用。

SERS可以有效克服传统拉曼光谱分子检测能力弱、灵敏度低的缺点。通过电化学方法使金属表面粗糙化,通过溅射等方法制作金属岛膜,或者制作各种贵金属胶体等^[4-5]都可以制造不同类型的SERS活性基底。其中,银和金的胶体^[6-12]以及其他金、银纳米复合材料易于制备,并具有高的增强因子,因此经常被用作SERS活性基底。但是贵金属胶体的大小、老化、聚集程度很难控制,在添加分析物后,金属胶体倾向于凝聚,导致SERS信号的重现性差,仅适合用于定性分析,不适合用于定量类型的精密分析。尽管添加稳定剂可以控制纳米颗粒的聚集和老化,但这样可能会造成光谱干扰,导致光谱解释复杂或簇表面失活^[13]。

罗丹明B(RhB)是一种常见的食品添加剂,但同时它也是一种疑似致癌物质,并且由于其自身的性质而难以检测^[14-15]。本文以还原置换法制备的金纳米颗粒胶体作为SERS活性基底,通过Fe³⁺的掺入来增强探针分子的反馈信号,提高检测灵敏度,然后分析了Fe³⁺的掺入浓度对优化植酸(IP6)封端的金纳米颗粒(IP6@Au NPs)活性的影响。结果表明,加入Fe³⁺后形成的SERS复合基底(IP6@Au NPs@Fe³⁺)能够显著提高对RhB检测的灵敏度。

2 实验

2.1 样品制备

将硝酸银溶液(150 mL,0.001 mol·L^-1)以及IP6溶液(5 mL,0.001 mol·L^-1)置于圆底烧瓶中,加热搅拌至沸腾后缓慢加入3 mL柠檬酸三钠溶液(质量分数为1%),随后持续搅拌6 h,获得IP6封端的银纳米颗粒胶体(IP6@Ag NPs)。加入适量去离子水,获得125 mL银纳米颗粒胶体(最终的银纳米颗粒胶体的浓度约为1.2 mmol·L^-1)。取10 mL上述银纳米颗粒胶体,添加适量的去离子水稀释至 25 mL,加热至50 ℃,并在快速搅拌的条件下加入5 mL氯金酸溶液(0.001 mol·L^-1)。最后,将溶液在50 ℃下保持30 min制备出金纳米颗粒胶体,记为IP6@Au NPs。在此过程中,得到了银、金混合纳米颗粒胶体,将其记为IP6@Ag NPs@Au NPs。

2.2 样品表征

将不同过程中获得的纳米颗粒胶体放入比色皿中,使用紫外-可见分光光度计对纳米颗粒胶体的吸光度进行研究。

将离心好的不同过程中的纳米颗粒胶体(IP6@Ag NPs、IP6@Ag NPs@Au NPs和IP6@Au NPs)滴到锡箔纸上烘干,并采用S-3400N型扫描电镜(SEM)进行形貌表征。

取出2 mL制备好的IP6@Au NPs,加入1 mL不同质量分数(0,0.28×10^-6,0.56×10^-6,0.84×10^-6)的Fe³⁺溶液形成IP6@Au NPs@Fe³⁺。将上述混合溶液在室温下搅拌1 min后加入1 mL RhB溶液,继续搅拌1 min。随后将混合溶液离心30 min,取出10 μL沉淀物,滴在凹型载玻片上,烘干后采用HR Evolution聚焦拉曼系统在1%的激光强度下检测拉曼信号(选用532 nm激光器)。

3 分析与讨论

3.1 SERS增强机理

IP6是一种环保的、易获得的天然化合物,由肌醇和6个磷酸离子构成,经常作为控型剂、螯合剂、稳定剂,在食品、医药等行业广泛应用^[16]。可以形成胶束的特性使得IP6可以作为制备纳米粒子的控型剂和稳定剂,其结构如图1所示。使用Fe³⁺作为连接剂的SERS基底的改善机制归因于IP6与Fe³⁺的相互作用。IP6分子的内在结构独特,使得IP6易于捕获金属离子,因此当加入适量的Fe³⁺时,Fe³⁺与IP6的氧原子配位形成了一种螯合物^[17-18]。这种IP6@Au NPs在Fe³⁺作用下螯合形成的Fe—O键,将IP6@Au NPs之间的距离拉近,从而使得IP6@Au NPs之间形成了更多稳定有效的热点,实现了IP6@Au NPs的可控聚集,产生了强大的电磁场,使SERS的增强效果得到提升,原理图如图2所示。

图 1. IP6结构示意图

Fig. 1. Structure diagram of IP6

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图 2. 以IP6@Au NPs为SERS基底通过添加Fe3+增加热点的示意图

Fig. 2. Schematic of IP6@Au NPs as a SERS substrate by adding Fe3+ to increase hot spots

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3.2 SEM图像以及紫外-可见吸收光谱

3.2.1 SEM图像

用SEM表征不同实验过程中的纳米粒子,结果如图3所示。图3(a)为IP6@Ag NPs的SEM图像,由于柠檬酸三钠加入的量和加入速度不同造成了纳米颗粒表现出各向异性,沿着不同的晶面方向生长成雪花状^[19-22]。图3(b)为IP6@Ag NPs@Au NPs与四氯金酸(HAuCl₄)反应过程中的纳米粒子的SEM图像,粒子基本都呈球形结构,且均匀性良好。当反应完全结束后,获得的IP6@Au NPs纳米粒子呈均匀的球形状态,如图3(c)所示。

图 3. 三种纳米颗粒的SEM图像。(a) IP6@Ag NPs;(b) IP6@Ag NPs@Au NPs;(c) IP6@Au NPs

Fig. 3. SEM images of three kinds of nanoparticles. (a) IP6@Ag NPs; (b) IP6@Ag NPs@Au NPs; (c) IP6@Au NPs

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3.2.2 紫外-可见吸收光谱

由图4中的黑色曲线可以看出,IP6@Ag NPs的最高吸收峰在450 nm左右,由于IP6胶束的影响,吸收光谱展宽。在置换过程中,由于同时存在IP6@Ag NPs和IP6@Au NPs,因此两个吸收峰在相互作用下,形成了图4中红色曲线所示的结果,在450 nm左右吸收光谱变高,并在533 nm处形成了IP6@Au NPs的明显的吸收峰。最后如图4中绿色曲线所示,450 nm处吸收峰明显下降,523 nm处的吸收峰增强,说明置换反应结束,生成了大小均一且分散性良好的IP6@Au NPs。

图 4. 三种纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱

Fig. 4. Ultraviolet-visible absorption spectra of three kinds of nanoparticles

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根据文献[ 17-18]的研究可知,IP6@Ag NPs通常在400 nm左右有很强的等离子体吸收峰,随着纳米粒子增大,吸收光谱出现展宽和偏移,与实验结果吻合。众所周知,米氏散射^[23-25]是在研究胶体金属粒子散射时建立的,米氏通过电磁波的麦克斯韦方程得到了关于光散射的严格解,解出了任意直径、任意成分的均匀粒子的散射规律^[23-25]。这种规律也证明了紫外吸收光谱的结果。

在本实验制备的IP6@Au NPs中,IP6作为稳定剂和连接剂存在于SERS基底中,如图5中透射电子显微镜(TEM)插图所示,正是由于IP6的存在,当添加适量Fe³⁺时,可以通过IP6与Fe³⁺的相互作用,拉近Au纳米颗粒之间的距离(约为2.33 nm),从而形成更多的热点,使电磁场增强,达到更好的SERS增强作用。随着Fe³⁺的加入,在523 nm左右,IP6@Au NPs的吸收峰变得平缓,如图5所示,此时IP6@Au NPs开始在Fe³⁺的作用下相互连接。从宏观上看,为了形成热点,Fe—O键的形成造成了一定程度的纳米粒子聚集现象。此外,当Fe³⁺的质量分数为0.84×10^-6时,紫外-可见吸收光谱的强度虽然有所下降,但当Fe³⁺质量分数为0.28×10^-6和0.56×10^-6时,曲线最平缓,这种现象的形成归因于此浓度下纳米粒子之间形成的Fe—O键最多。因此,随着Fe³⁺浓度增加,形成热点的数量先增多后下降,SERS增强效果同样先升高后下降,故Fe³⁺的质量分数为0.28×10^-6~0.56×10^-6时,RhB信号的增强效果最好。

图 5. 添加不同浓度Fe3+后IP6@Au NPs的紫外-可见吸收光谱图

Fig. 5. Ultraviolet-visible absorption spectra after adding different concentrations of Fe3+ in IP6@Au NPs

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3.3 IP6@Au NPs@Fe3+作为SERS基底检测RhB

使用10^-7 mol·L^-1的RhB作为分子探针,以金纳米颗粒中掺入不同浓度Fe³⁺的复合材料作为SERS基底检测RhB。从图6(a)中可以看出,在SERS基底不添加Fe³⁺的情况下,拉曼探测信号非常微弱,很难分辨出RhB的特征峰。将图6(a)中未添加Fe³⁺时的拉曼光谱进行放大,如图6(b)所示,可以看出RhB的特征峰,但信号强度很低,且背景峰杂乱。当掺入质量分数为0.28×10^-6和0.56×10^-6的Fe³⁺时,RhB的特征峰大幅增强,可以明显区分RhB的特征峰以及其他的干扰峰。更高浓度的Fe³⁺的掺入会影响到拉曼信号,当加入质量分数为0.84×10^-6的Fe³⁺时,原本低浓度掺入引起的增强峰均明显降低,虽然还有一些很强的吸收峰,但与低浓度掺入时的效果进行对比后可以发现,其增强效果并不理想,并且受到了很多其他信号的干扰,使得RhB的特征峰值出现明显的错位,甚至消失,这正好证实了紫外-可见吸收光谱得到的结果。除此之外,对1100~1200 cm^-1处的拉曼峰强进行了线性拟合,线性关系如图6(c)所示。因此,在对污水进行检测处理时,可以通过拉曼峰的强度对Fe³⁺浓度进行估算,这将为Fe³⁺的检测提供很大帮助。

图 6. 以IP6@Au NPs@Fe3+为SERS基底的RhB(10-7 mol·L-1)的拉曼光谱图。(a)含有不同浓度Fe3+的复合基底;(b)未添加Fe3+的基底;(c) 1100~1200 cm-1之间的拉曼强度线性拟合图

Fig. 6. Raman spectra of RhB (10-7 mol·L-1) with IP6@Au NPs@Fe3+ as SERS substrate. (a) Composite substrate containing different concentrations of Fe3+; (b) substrate without Fe3+; (c) linear fitting chart of Raman intensity between 1100 cm-1 and 1200 cm-1

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选取质量分数为0.28×10^-6的Fe³⁺加入IP6@Au NPs中形成的纳米复合SERS基底,用于检测更低浓度的RhB。图7给出了RhB浓度分别为10^-7 mol·L^-1和10^-8 mol·L^-1时,SERS增强的对比结果。可以看出,当使用探针分子的浓度为10^-8 mol·L^-1时,拉曼测试的结果比10^-7 mol·L^-1时的增强效果略有衰减,但主要吸收峰依然可见。由此可以看出,IP6@Au NPs在Fe³⁺的作用下对低浓度(10^-8 mol·L^-1)RhB仍具有明显的增强效果。尽管在SERS发展过程中,学者们认为银的SERS增强效果优于金,但对比Gao等^[26]使用羟基磷灰石银纳米复合材料作为SERS基底检测RhB的研究结果可知,本实验使用的IP6@Au NPs@Fe³⁺具有更好的检测效果及灵敏度。另外,在本实验测试过程中意外发现了拉曼测试中进行激光淬灭可以降低背景荧光峰的现象^[27],在该SERS基底下检测RhB时,可以在较高的激光强度下对样品进行照射,经过几次高激发光强的照射后,可以使RhB检测时出现的荧光效应降低。因此,对RhB进行检测时,淬灭后出现的特征峰以及曲线比未淬灭时更好。

图 7. 以IP6@Au NPs@0.28×10-6 Fe3+为SERS基底检测不同浓度RhB的拉曼光谱图

Fig. 7. Raman spectra of different concentrations of RhB detected with IP6@Au NPs@0.28×10-6 Fe3+ as SERS substrate

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4 结论

使用还原法将硝酸银中的银离子在IP6的环境下还原成以单质形态存在的银纳米颗粒胶体,然后利用这种单质态的银纳米颗粒与HAuCl₄反应,置换生成金纳米颗粒胶体。按比例混合Fe³⁺与金纳米颗粒胶体,以获得增强性能优异的SERS基底IP6@Au NPs@Fe³⁺,最后使用RhB作为探针分子进行拉曼光谱表征,检测极限可达到10^-8 mol·L^-1。此外,通过对掺入不同浓度Fe³⁺的SERS基底,即IP6@Au NPs@Fe³⁺的增强效果进行表征,并与IP6@Au NPs测试RhB的拉曼光谱进行对比,结果发现,随着Fe³⁺浓度增加,增强效果呈先提高而后下降的趋势。在掺入低浓度Fe³⁺(质量分数为0.28×10^-6和0.56×10^-6)的条件下,IP6@Au NPs@Fe³⁺有着非常优异的增强效果;在掺入较高浓度Fe³⁺(质量分数为0.84×10^-6)时,Fe³⁺造成了SERS基底的超载,使纳米颗粒团聚严重,未能形成有效的热点,影响了原本探针分子RhB的测试信号,导致SERS增强效果减弱。