快速准确获取水体细菌微生物浓度信息,对饮用水卫生安全监管具有重要意义。基于多波长透射光谱技术研究了水体细菌微生物浓度定量反演方法,并重点研究了光谱数据的归一化处理方法(颗粒浓度归一化、最大值归一化、积分归一化、平均归一化)对水体细菌微生物浓度反演结果准确性的影响。基于Mie散射理论建立了大肠埃希氏菌(大肠杆菌)多波长透射光谱解析模型,通过对归一化后的光谱进行解析,获取了大肠杆菌的结构信息,并以此构建出单种细菌的多波长透射参考光谱;根据测量光谱与单种细菌参考光谱的相关性反演细菌浓度,并对比分析了不同归一化处理方法下细菌浓度反演结果的准确性。研究结果表明:与平板菌落计数法相比,平均归一化光谱反演细菌浓度的最大相对误差为0.92%,平均相对误差为0.70%,线性相关系数达到0.9984,其准确性和稳定性均为最优。本研究为水体细菌微生物的快速定量检测与预警提供了基础数据。

多波长透射光谱能够反映出样品细胞大小、 形状、 内部结构和化学组分等丰富而独特的信息， 是微生物快速、 实时、 在线检测与识别的有利工具。 将多波长透射光谱技术应用于水体致病性细菌微生物的快速有效检测对控制水体细菌微生物污染及保护饮用水源水质安全具有重要的现实意义。 为了建立及发展基于多波长透射光谱技术的水体致病性细菌微生物快速有效的检测方法， 采用紫外-可见分光光度计获取了多种水体致病性细菌微生物（如： 肺炎克雷伯氏菌、 鼠伤寒沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）在200～900 nm波段的多波长透射光谱， 对比分析了不同细菌及同种细菌在不同浓度时的多波长透射光谱特征。 结果表明： 对于同种细菌， 当细菌浓度发生变化时， 400～900 nm波段透射光谱形状较为一致， 并且在400， 450， 500和550 nm波长处的光密度值与浓度具有很好的线性关系， 该波段由细菌体的散射起主要作用； 但在200～400 nm波段范围内， 细菌透射光谱的形状随细菌浓度的变化而变化， 在200， 258， 300和350 nm波长处的光密度值与细菌浓度分别具有很好的二次多项式关系。 根据微粒的Mie散射理论， 采用Levenberg-Marquardt非线性最小二乘方法对测得的四种细菌透射光谱进行了散射光谱和吸收光谱拟合， 并对比分析了不同细菌散射光谱特征和吸收光谱特征， 结果表明： 四种细菌散射光谱的特征峰均在245 nm波长处， 但该波长处的光密度值具有明显差异性， 这与不同细菌外部结构及内部结构细胞器的大小、 形状等不同有关； 而四种细菌吸收光谱特征峰均在260 nm波长处， 且不同细菌在240～400 nm波段内吸收光谱也具有明显差异性， 这与不同细菌细胞内的核酸、 蛋白质等化学组分含量不同有关。 该研究表明对于不同种细菌及具有不同浓度的同种细菌， 测得的多波长透射光谱及计算出的散射光谱和吸收光谱特征都具有明显的不同， 通过多波长透射光谱解析可以获得细菌多种特征参数， 多波长透射光谱可以被用于快速有效检测水体中的致病性细菌微生物。 该研究为发展水体细菌微生物快速在线监测仪提供了重要依据。

搭建的水体细菌微生物多波长透射光谱快速测量实验系统, 实验获取了肺炎克雷伯菌、 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在不同浓度下220～900 nm范围内的多波长透射光谱, 研究建立了三种细菌基于不同波长点及全光谱波段的浓度校准曲线, 计算了肺炎克雷伯菌、 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测限, 并与紫外-可见分光光度计测量分析结果进行了对比。 结果表明, 实验系统与紫外-可见分光光度计测量光谱线性相关系数在0.999 8以上, 具有非常好的一致性, 且30次光谱信号采集时间仅需15 s; 基于实验系统分析得到三种细菌在220, 258, 300, 350, 400, 450, 500和550 nm不同波长点以及全光谱波段的检测限结果均优于紫外-可见分光光度计, 且利用多波长透射光谱全光谱波段计算得到的细菌检测限均最低, 其中: 肺炎克雷伯菌、 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的检测限分别为1.60×104, 1.06×104和1.16×104 cells·mL-1。 研究结果为进一步发展水体细菌微生物的多波长透射光谱快速定量检测技术提供了基础数据。

细菌多波长透射光谱包含有细菌结构、组分、浓度等信息,这些特征信息的有效提取是实现细菌微生物快速识别与检测的基础。以水体常见的大肠埃希氏菌(大肠杆菌)为研究对象,采用紫外-可见分光光度法获得了其多波长透射光谱;基于Mie散射理论,在充分考虑水体大肠杆菌散射和吸收特性的基础上,构建了240~900 nm波段范围内细菌微生物多波长透射光谱的解析模型;基于该模型对250~750 nm特征波段范围内的光谱进行解析,获得了大肠杆菌的体积、粒径、结构及浓度等相关参数,并将这些参数与文献及实验得到的结果进行了对比验证。结果表明,建立的多波长透射光谱解析模型能够准确表征水体细菌微生物的光谱特征,该模型可为水体细菌微生物的快速识别分析和检测提供关键数据。

为实现水体细菌微生物快速在线监测, 搭建了多波长透射光谱快速测量实验系统, 利用该系统分别测量了重铬酸钾标准溶液紫外波段及中性滤光片可见波段的透射光谱, 并与紫外-可见分光光度计测得的透射光谱进行对比分析, 验证了实验系统测量透射光谱的准确性; 以水体中常见的金黄色葡萄球菌作为研究对象, 利用搭建的实验系统获取金黄色葡萄球菌溶液在220～900 nm波段的前向小角度透射光谱, 进一步验证了实验系统测量细菌微生物透射光谱的准确性和快速性。 结果表明, 由实验系统和紫外-可见分光光度计测得的重铬酸钾标准溶液, 与中性滤光片紫外波段及可见波段透射光谱的线性拟合相关系数分别为0.999 7和0.999 5, 光密度误差分别在5.00%和4.58%以内, 说明两个系统测量光谱的一致性较好, 所搭建的实验系统测量标准样品紫外-可见透射光谱准确度较高; 对于金黄色葡萄球菌, 实验系统测得的透射光谱经过校正后, 与紫外-可见分光光度计测得的透射光谱线性拟合的相关系数为0.999 97, 两者相比的光密度误差在0.74%以内; 系统重复30次细菌光谱信号采集获得平均透射光谱单次测量时间为15 s, 说明该实验系统相对于紫外-可见分光光度计能够快速准确获取水体细菌微生物多波长透射光谱, 在保证测量结果准确的同时缩短了光谱测量时间, 为水体细菌微生物快速检测提供技术支持。

紫外可见多波长透射光谱包含了细菌微生物对光的吸收和前向散射等信息, 能反映细菌细胞的组分、 大小以及形态等特征, 具有细菌种属的特异性, 可应用于细菌微生物的快速种类鉴别。 以水体中常见细菌微生物为研究对象, 实验测量了大肠埃希氏菌、 金黄色葡萄球菌、 鼠伤寒沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌的紫外可见多波长透射光谱, 简要分析了不同种类细菌微生物的多波长透射光谱特征; 研究了透射光谱与支持向量机多向量分析方法相结合的水体细菌微生物快速识别方法, 利用基于网格搜索法的训练集内部交叉验证获取建模所需最佳惩罚因子C和核函数参数g, 根据最优参数和LibSVM一对一多分类法建立细菌快速分类鉴别模型。 利用不同株实验细菌的透射光谱作为测试集对所建模型进行识别正确率的验证, 结果表明, 所建立的快速分类鉴别模型可以对选取的大肠埃希氏菌、 金黄色葡萄球菌、 鼠伤寒沙门氏菌以及肺炎克雷伯菌进行快速种类识别, 识别正确率为100%; 分类鉴别模型对不同大肠杆菌亚种的测试集识别正确率为100%, 证明该模型对细菌属间鉴别具有较好的稳定性。 不仅可为饮用水源细菌微生物的快速识别预警提供方法, 而且可在生物医学方面作为细菌微生物鉴别的一种简便、 快速、 准确的手段。