1 引言

微藻作为水生生态系统的初级生产者,具有对毒性敏感、易于培养等特点,是毒性分析的理想受试生物^[1-2]。国际化学品毒性检测标准方法“藻类生长抑制试验”,以96 h藻细胞生长密度的半数抑制效应浓度(EC50)表征急性毒性作用的程度,该方法准确可靠,但样品预处理过程复杂,且受细胞繁殖代谢周期限制,测量周期长。1991年,Krause等^[3]提出将叶绿素荧光作为光合机构损伤的早期敏感指标。利用藻类叶绿素荧光可以快速、非侵入性地评价藻类光合性能并分析其保护反应,藻类叶绿素荧光不仅可被用于测定自然环境中藻类光合作用的生理状态,还可用于生态生理学和毒理学研究,检验环境变化和污染物对藻类的影响^[4]。藻类叶绿素荧光实验的亚致死特征(与生态相关),使其比传统的生物量方法更敏感^[5]。1999年,Gensemer等^[6]对荧光变量与叶绿素浓度进行了比较,结果发现荧光变量对蒽的反应较早。

随着荧光分析技术的发展,藻类更多的光合活性参数可用荧光动力学方法来获取,这些参数对应着光合作用电子输运流的不同过程。不少学者已经开展了基于藻类光合活性参数的毒性评估实验,如:Pérez等^[7]通过对比Cu对几种生物学变量和光合活性参数的影响,证明了所有测试变量中的可变荧光(Fv)是最敏感且最快速的;Kottuparambil等^[8]在苯酚对裸藻的急性毒性实验(1 h)中发现苯酚能显著降低光系统(PSⅡ)的最大量子产率(Fv/Fm)和最大光合电子传递速率(rETRmax),且对后者更敏感;Herlory等^[9]在铀暴露于莱茵衣藻的研究中证明了非光化学淬灭(qN)是最敏感的光合活性参数。但已有研究主要利用单一光合活性参数对毒性进行定性分析,尚未见利用不同光合活性参数对毒性敏感差异性、响应时间等的分析。

本文以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa,FACHB-5)为受试藻种,以藻类光合活性参数为毒性评价指标,选择工业废水中的典型污染物苯酚作为研究对象,筛选苯酚胁迫下有明显变化的光合活性参数,研究苯酚胁迫下蛋白核小球藻光合活性参数的响应规律,探讨苯酚对蛋白核小球藻的生理影响,确定光合活性参数对苯酚毒性的最佳响应时间,并对比各参数对苯酚毒性响应程度的差异性。

2 材料与方法

2.1 藻种的培养与溶液配制

实验藻种选择采购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库的蛋白核小球藻,用BG11培养基进行接种,将接种后的藻液置于恒温摇床培养箱(MQD-S3R)中进行扩大培养,采用的光源为白色冷荧光灯管,设置温度为(25±1) ℃,转速为120 r/min,光照强度为120 μmol·m^-2·s^-1,光暗比12 h∶12 h。实验前,保证藻液培养2 d,达到对数生长期。

胁迫实验采用的药剂为苯酚(分析纯),苯酚储备液用去离子水配制。实验在100 mL的三角锥形瓶中进行,藻液体积为50 mL,藻类初始叶绿素的质量浓度控制在100~200 μg·L^-1,苯酚胁迫物的添加体积为1 mL(排除藻液稀释造成的干扰)。根据美国生态毒理数据库(ECOTOX)提供的数据,以淡水小球藻为指示生物,以生长抑制率为毒性评价指标,得到苯酚对小球藻的96 h EC₅₀(抑制率达到50%对应的毒物浓度)为370 mg·L^-1。根据该数据设置实验的苯酚浓度范围,具体的实验条件如表1所示。

2.2 光合活性参数的获取

光合活性参数由可变光脉冲诱导荧光分析仪(AGHJ-TPLIF-I,中国科学院安徽光学精密机械研究所)测得^[10-11]。整个测量周期约为3 min,将样品置于8个连续光化光水平下,光化光强度从0上升到800 μmol·photons·m^-2·s^-1,构建快速光曲线,即对每一层光化光计算相对电子传递速率rP,并由其得到一系列光合活性参数,结果如表2所示。对于随光强变化的参数rP、JVPⅡ,选取一系列光强下的最大值。

光合活性参数对苯酚的响应结果以抑制率的形式表示,抑制率Y的计算公式为

Y=X0-XiX0×100%,(1)

式中:Y为苯酚对光合活性参数的抑制率;X₀为对照组光合活性参数;X_i为实验组光合活性参数。

3 结果与讨论

3.1 参数筛选

测定苯酚胁迫24 h后对照组和实验组的多个光合活性参数,包括Fv/Fm(PSⅡ最大光化学量子产量)、rP(相对光合电子传递效率)、α(最大光利用系数)、Ek(饱和光强)、JVPⅡ(PSⅡ单位体积通量)和σ_PSⅡ(有效吸收截面),利用单因素方差分析(one-ANOVA)和T-检验方法分析实验组与对照组的显著性差异,确定苯酚胁迫下有明显变化的光合活性参数,结果如表3所示(“*”“**”分别表示在0.05和0.01水平上有差异)。

由表3可知:苯酚对光合活性参数Fv/Fm、rP、α、Ek、JVPⅡ的抑制效应显著;当苯酚质量浓度为0.1 g·L^-1时,JVPⅡ(p<0.05)表现出明显的抑制效应,其余参数与对照组无显著差异(p>0.05);当苯酚质量浓度为0.2、0.4、0.8 g·L^-1时,Fv/Fm、rP、α、Ek、JVPⅡ均表现出显著抑制(p<0.05)或极显著抑制(p<0.001)效应;而有效吸收截面σ_PSⅡ在不同浓度苯酚胁迫下实验组与对照组结果无显著差异,表明苯酚对藻类光合系统PSⅡ的吸收截面影响较小。因此,选择Fv/Fm、rP、α、Ek、JVPⅡ参数,进一步研究苯酚急性毒性作用下72 h与70 min内不同光合活性参数的响应规律。

3.2 长期胁迫下参数的响应规律

为了研究光合活性参数对苯酚长期毒性的响应规律,分别在胁迫1,13,24,48,72 h时获取光合活性参数,计算苯酚对各个光合活性参数的抑制率,得到不同浓度苯酚在不同胁迫时间下光合活性参数的响应值,如图1~2所示。

图 1. 长期胁迫条件下光合活性参数Fv/Fm对不同浓度苯酚的响应规律。(a)各时段Fv/Fm对苯酚的剂量效应; (b) Fv/Fm对苯酚的时间效应趋势

Fig. 1. Response of photosynthetic activity parameters Fv/Fm to different phenol concentrations unde long-term stress. (a) Dose-effect of Fv/Fm on phenol at different time; (b) time-effect trend of Fv/Fm on phenol

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图 2. 长期胁迫条件下光合活性参数对不同浓度苯酚的响应规律。(a) rP;(b) α;(c) Ek;(d) JVPⅡ

Fig. 2. Responses of photosynthetic activity parameters to different phenol concentrations under long-term stress. (a) rP; (b) α; (c) Ek; (d) JVPⅡ

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首先分析毒性测试常用参数Fv/Fm对苯酚毒性的响应规律。苯酚为强氧化剂,通过诱导活性氧(ROS)的形成来抑制微藻的光合系统Ⅱ的活性(用参数Fv/Fm表征)。在整个实验周期内(72 h),Fv/Fm对苯酚具有明显的毒性响应。从剂量效应关系分析,如图1(a)所示,苯酚浓度越高,对Fv/Fm的抑制作用越强;低剂量(0.1 mg·L^-1)苯酚胁迫时,抑制率呈负值,说明低剂量苯酚对光合活性参数Fv/Fm有些许促进作用。从时间效应上分析,如图1(b)所示,抑制作用呈现先上升后下降的趋势,以最高质量浓度(0.8 g·L^-1)的苯酚为例,胁迫48 h后抑制率达到最高,为55%,随后72 h降为43%,而苯酚质量浓度为0.2 g·L^-1时,胁迫48 h后,基本无明显的毒性响应。这说明后期光合活性出现了不同程度的恢复,这与Zhou等^[14]得到的微藻对苯酚有一定耐受力、降解能力的结论相符。

光合活性参数rP、α、Ek、JVPⅡ对苯酚的响应规律如图2所示。图2表明,在苯酚胁迫下,蛋白核小球藻对光的捕获能力(用参数α表征)和耐受能力(用参数Ek表征)降低,对光能的利用效率(参数JVPⅡ与rP表征)减弱。从浓度效应上分析,苯酚浓度越高,相对电子传递效率、最大光利用系数、饱和光强、单位体积PSⅡ通量受到的抑制作用越强,该结果与Fv/Fm的观察结果相似。从时间效应上分析,4个参数对苯酚的响应均未呈现任何时间规律性,但胁迫1 h后具有明显的剂量效应,在高浓度苯酚胁迫下,rP、α、Ek、JVPⅡ对毒性的响应值分别能达到72.5%、36.6%、63.6%、57.3%,均高于Fv/Fm。

3.3 短期胁迫下参数的响应规律

在胁迫1 h,可以观察到蛋白核小球藻光合活性参数对苯酚敏感且有规律的毒性响应。因此,进一步研究70 min内各参数的响应规律。以5 min为最短测试时间,胁迫5,10,20,30,40,50,60,70 min后分别获取光合活性参数,计算苯酚对各个光合活性参数的抑制率,得到不同浓度苯酚对光合活性参数的抑制率随时间变化的趋势,结果如图3所示。

图 3. 短期胁迫条件下光合活性参数对不同浓度苯酚的响应规律。(a) Fv/Fm;(b) rP;(c) α;(d) Ek;(e) JVP Ⅱ

Fig. 3. Responses of different photosynthetic activity parameters to different phenol concentrations under short-term stress. (a) Fv/Fm; (b) rP; (c) α; (d) Ek; (e) JVP Ⅱ

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由图3可知,各光合活性参数对苯酚的响应呈相似的时间响应规律,即在胁迫5 min时表现出明显的抑制效应,随后,随时间的推移抑制作用具有上升趋势,但整体而言,短期胁迫下,苯酚基本不会对光合活性参数造成持续性的抑制作用,各参数值也不会得到恢复。胁迫70 min内,5 min时各光合活性参数的抑制效率已经接近最大,且响应结果稳定。

3.4 短期胁迫下剂量效应分析

分别计算蛋白核小球藻被质量浓度为0.2~1.2 g·L^-1的苯酚胁迫5 min时各参数的抑制率以及胁迫70 min内不同时间点各参数抑制率的平均值,得到两条剂量效应曲线,如图4所示。

图4结果表明,在苯酚的胁迫下,各参数5 min的剂量效应趋势与70 min的平均结果基本一致,在不影响毒性响应效果的前提下,响应时间越短越好,参数JVPⅡ 5 min的剂量响应效果比70 min平均效果好,5 min的剂量效应曲线几乎呈线性关系,该曲线关系更适用于毒性分析。因此,5 min可以作为光合活性参数对苯酚毒性的响应时间,过长的胁迫时间不仅会导致毒性检测效率降低,还可能会引入更多的影响因素,例如代谢过程中PH的变化、培养环境温度和光照的变化等。胁迫5 min后,除了参数α外,参数Fv/Fm、rP、Ek、JVPⅡ响应值均随苯酚浓度升高呈稳步上升的趋势,具有良好的剂量效应关系。

图 4. 蛋白核小球藻被苯酚胁迫5 min时各光合活性参数的抑制率以及胁迫70 min内各参数抑制率的平均值。(a) Fv/Fm;(b) rP;(c) α;(d) Ek;(e) JVPⅡ

Fig. 4. Comparison of dose-response trends of photosynthetic activity parameters under stress for 5 min and 70 min on average. (a) Fv/Fm; (b) rP; (c) α; (d) Ek; (e) JVPⅡ

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进一步对比4个参数对苯酚的响应程度,结果如图5所示,胁迫5 min后,质量浓度为0.2~1.2 g·L^-1的苯酚对Fv/Fm的抑制率为-3%~19%,对rP的抑制率为9%~67%,对Ek的抑制率为15%~74%,对JVPⅡ的抑制率为17%~37%。从响应跨度上分析,rP与Ek明显大于Fv/Fm与JVPⅡ,说明参数rP与Ek对苯酚毒性更敏感。

图 5. 蛋白核小球藻被苯酚胁迫5 min后光合活性参数Fv/Fm、rP、Ek、JVPⅡ对苯酚响应程度的对比

Fig. 5. Comparison of responses of photosynthetic activity parameters Fv/Fm, rP, Ek, and JVP II to phenol under stress for 5 min

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4 结论

在生态毒理学中,毒性时间是一个关键因素,研发能够快速产生毒性结果且不丧失敏感性的测试方法将是主要的发展趋势。基于藻类光合活性参数的生物毒性检测方法突破了传统“藻类生长抑制试验”毒性检测方法受细胞繁殖周期限制、测量周期长的瓶颈,具有响应快速、参数丰富和测量简捷等特点,是极具潜力的水体污染毒性快速检测预警手段。本文以蛋白核小球藻为受试生物,研究了藻类光合活性参数对苯酚毒性的响应规律,结果表明:苯酚对光合活性参数Fv/Fm、rP、α、Ek、JVPⅡ具有显著抑制效应,而对有效吸收截面σ_PSⅡ的影响较小;在苯酚急性毒性的作用下,光合活性参数的毒性响应在短时间内可达到稳定,5 min可作为苯酚毒性分析的响应时间;不同光合活性参数对苯酚毒性的响应程度不同,质量浓度为0.2~1.2 g·L^-1的苯酚对Fv/Fm、rP、Ek、JVPⅡ的抑制率分别为-3%~19%,9%~67%,15%~74%,17%~37%。该研究结果为毒性物质快速检测以及生态毒理学研究提供了一种新方法。采用该方法进行毒性定量分析时,会受藻种、藻液浓度、温度、光照等各方面因素的影响,如何稳定实验条件是今后的研究重点。