藻类光合抑制法是极具潜力的水体综合毒性快速检测预警手段,并且稳定测量条件的确定对藻类光合抑制法毒性测试结果不可忽视。以蛋白核小球藻为受试藻种,根据农药敌草隆(DCMU)对藻类光合活性具有抑制作用这一特点,以α、Fv/Fm、Yield、rP 4种光合荧光参数的抑制率为分析对象,在不同质量浓度DCMU胁迫作用下,分别研究受试藻类质量浓度、藻液与样品混合体积比、反应温度这3种测试条件对水体综合毒性测量的稳定性影响。结果显示:当受试藻类在100~600 μg·L ^-1质量浓度范围内时,藻类质量浓度的变化对水体综合毒性测量没有显著影响;受试藻液与样品的混合体积比对毒性检测灵敏度有较大影响,受试藻液与样品的混合体积比为2∶8时更有利于提高水体毒性检测的灵敏性;反应温度对水体综合毒性检测也有重要影响,其中20~35 ℃的温度范围更有利于提高水体综合毒性的检测精度。

藻类作为单细胞生物, 其个体小、 易培养、 对毒物敏感、 且能够观察细胞水平上的中毒症状, 是快速检测水质生物毒性的理想受试生物。 “藻类生长抑制试验”依赖于藻类细胞的繁殖代谢过程, 测量周期长, 无法满足生物毒性快速检测的需求。 藻类光合作用过程对污染物毒性的响应速度和灵敏度显著优于“藻类生长抑制试验”, 以藻类光合作用状态为毒性测试指标可大幅缩短毒性检测时间。 现有“光合作用抑制实验”多采用可变荧光Fv或最大光化学量子产量Fv/Fm作为生物毒性反应终点, 缺乏对多个光合荧光参数响应敏感性的对比分析, 造成生物毒性定量检测的灵敏度不高。 以蛋白核小球藻为受试对象, 以叶绿素荧光作为藻类光合作用状态快速无损探针, 采用荧光动力学手段测量藻类光合荧光参数, 对典型除草剂DCMU抑制下的多个光合荧光参数的毒性响应敏感性进行对比分析, 得到适用于快速、 定量评价DCMU胁迫效应的关键光合参数, 提高DCMU生物毒性检测的速度和灵敏度。 结果显示: (1)DCMU对光合荧光参数F0, Fm, σPSⅡ, τQA, Fv, Fv/Fm, Yield, rP, NPQ, α响应显著, 其中参数α, rP, Fv/Fm, yield和NPQ在5 min即呈现出类似时长（96 h）的响应效应; (2)参数α, rP, Fv/Fm, yield和NPQ的5 min抑制程度对DCMU浓度具有良好的剂量效应关系。 其中, 参数NPQ的相关系数和EC50-5 min分别为0.998 5和2.41 μg·L-1, 显著优于其他四个参数, 且优于96 h的测量结果。 采用光合荧光参数NPQ作为5 min定量测量DCMU生物毒性的反应终点, 可极大缩短DCMU生物毒性的检测时间（从96 h缩短至5 min）, 并显著提高检测灵敏度（与光合抑制方法常规参数Fv/Fm相比, EC50降低了81.4%）。 实验结果为基于藻类光合抑制效应的DCMU生物毒性定量检测提供了基础数据, 研究方法也为其他污染物胁迫下的藻类光合荧光参数筛选提供了参考。

以蛋白核小球藻为受试对象,以藻类光合荧光参数为毒性评价指标,研究Cu 2+毒性作用下多个光合荧光参数的响应规律。结果显示:Cu 2+对光合荧光参数F0、Fm、Fv、Fv/Fm、Yield、rP、JVPⅡ、α和Ek抑制效应显著,其中Yield、rP、α和Fv/Fm在24 h内体现出稳定的抑制效应,可作为24 h分析Cu 2+毒性的评价指标;Yield、rP、α和Fv/Fm抑制程度对Cu 2+浓度具有良好的剂量效应关系,logistic函数拟合相关系数R2分别为0.9989,0.9992,0.9991,0.9977,由此得到EC50-24h值分别为61.05,66.31,69.41,99.61 μmol·L -1。因此,参数Yield、rP、α的拟合相关系数优于常规参数Fv/Fm,其对应的EC50-24h分别降低了38.7%,33.45%,30.3%。研究结论可为基于藻类光合抑制效应的生物毒性测试指标选择提供参考。

以蛋白核小球藻为受试对象,以藻类光合活性参数为毒性评价指标,研究了在苯酚急性毒性作用下的72 h与70 min内,不同光合活性参数的响应规律。结果显示:苯酚对光合活性参数Fv/Fm、rP、α、Ek、JVPⅡ的抑制效应显著;在苯酚急性毒性的作用下,光合活性参数的毒性响应可在短时间内达到稳定,5 min可作为苯酚毒性分析的响应时间;Fv/Fm、rP、Ek、JVP Ⅱ对苯酚毒性具有良好的剂量响应关系,不同光合活性参数对苯酚的毒性响应程度不同,0.2~1.2 g/L的苯酚对Fv/Fm、rP、Ek、JVP Ⅱ的抑制率分别为-3%~19%,9%~67%,15%~74%,17%~37%。

以蛋白核小球藻、 铜绿微囊藻、 斜生栅藻为敏感藻, 研究了莠去津、 敌稗、 敌草隆、 灭草松四种除草剂及其混合剂对藻类光合特性的影响规律, 实验同时确定了三种微藻荧光对除草剂的最佳响应时间。 实验结果表明, 除草剂显著降低了藻细胞类囊体膜中光系统Ⅱ的最大光合效率(Fv/Fm)、 实际光合效率(Y(Ⅱ))、 绝对电子传递速率(ETR)和光化学猝灭系数(qP), 而非光化学猝灭系数(qN)呈现上升趋势, 400 μg·L-1敌草隆使蛋白核小球藻Fv/Fm参数值下降了41%。 实验选用的三种实验藻在四种除草剂单独和混合胁迫下均发生了不同程度的光抑制效应, 表现出光合效率、 电子传递速率、 光合活性的降低和光保护能力的增强, 藻类自身具有一定的光保护机制可以降低除草剂的影响。 除草剂能够影响藻细胞叶绿素荧光强度, 其中灭草松对蛋白核小球藻的影响最为显著, 在400 μg·L-1灭草松影响下蛋白核小球藻的叶绿素荧光强度下降了44%。

利用共聚焦显微拉曼光谱仪获取生长在三种氮营养条件下(氮胁迫、 氮正常、 氮饱和)培养的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的拉曼光谱, 通过拉曼散射光谱信息对微藻在不同氮胁迫下生长情况及油脂变化进行研究。 对油脂拉曼特征峰值比值作气泡图以直观表达油脂积累量, 该气泡图与尼罗红荧光图像具有良好的相关性。 光谱信号经预处理后, 利用主成分分析(PCA)对全波段进行分析, 获得相应的主成分变量, 通过线性判别分析(LDA)建立分类模型。 利用PCA获取的主成分变量建立的LDA预测模型对三种氮营养条件的预测正确率分别是80%, 93.3%, 86.7%。 基于油脂特征位移(RS)处的比率建立的LDA分类模型对三种氮营养条件的分类正确率最高达到86.7%。 研究结果表明, 利用拉曼技术对微藻生长的不同氮胁迫条件鉴别是可行的, 且随着氮胁迫影响的时间增加, 油脂的积累差异就越大。

设计实验研究多种重金属胁迫藻类的联合毒性,更有利于阐明真实环境中重金属与藻类的毒性作用过程和机理。 采用叶绿素荧光分析技术结合24析因设计方法研究重金属Hg2 + 、Cd2 + 、Cu2 + 和Zn2 + 胁迫蛋白核小球藻的联 合毒性作用,得到主效应Hg、Cd、Cu、Zn以及交互作用Hg*Cu、Hg*Zn和Hg*Cu*Zn对蛋白核小球藻潜在最大 量子效率Fv/Fm具有显著性影响(Sig.<0.05)的结论:通过多元线性回归拟合得到联合重金属浓度与藻 类光合活性抑制率间的剂量-效应关系,得到模型表达式: y［%］=－22.557+19.926Hg+5.282Cu+0.015Zn+0.029Hg*Zn－0.002Hg*Cu*Zn,并对 联合重金属胁迫蛋白核小球藻的机理做出解释;通过对模型进行统计 学检验和实验验证,证明该模型可用于实验室条件下已知种类重金属Hg2 + 、Cd2 + 、 Cu2 + 、Zn2 + 胁迫蛋白核小球藻的联合毒性估计。

利用叶绿素荧光技术, 对受相同浓度Cu2+胁迫的蛋白核小球藻、斜生栅藻、铜绿微囊藻的最佳暗适应时间进行研究.通过对三种供试藻在光照和暗适应时间分别为30 s、1 min、3 min、5 min、10 min和20 min条件下的光合荧光参量进行测定, 以光化学淬灭参量值为主要参考依据, 结合t检验方法对暗适应时间进行显著性差异分析, 结果表明: 暗适应条件下三种供试藻的潜在最大量子效率值略有增加, 实际量子效率值基本保持不变；蛋白核小球藻和斜生栅藻的光化学淬灭参量值和非光化学淬灭参量值随暗适应时间的延长显著增加；铜绿微囊藻光化学淬灭参量值在光照1 min时达到最大, 无需进行暗适应, 这可能与蓝藻在暗适应时发生状态转换有关；藻类不是暗适应时间越长越好, 蛋白核小球藻和斜生栅藻的最佳暗适应时间分别为5 min和10 min.这将为采用叶绿素荧光技术进一步研究毒物对藻类的胁迫机理提供可靠依据.

采用脉冲振幅调制(PAM)技术，对同一浓度金属离子Hg2+、Cd2+、Cu2+、Zn2+对斜生栅藻、蛋白核小球藻、普通小球藻的抑制作用进行了测定研究。通过对3种藻叶绿素a PSⅡ系统各荧光参数的测定，以抑制率和重金属响应时间为分析参考依据，确定蛋白核小球藻为4种重金属的敏感藻种。3种不同藻对4种重金属的敏感度为：蛋白核小球藻>斜生栅藻>普通小球藻，4种重金属对蛋白核小球藻的急性毒性大小为：Hg2+>Cu2+>Cd2+>Zn2+。与传统的藻类生长抑制实验相比，该敏感藻种筛选方法具有简便、快速的优点。

采用三维荧光光谱和Δλ=20 nm同步扫描荧光光谱技术研究Hg2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+胁迫作用下蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)荧光光谱的变化情况, 两种光谱技术得到了较为一致的结论: 即胁迫作用96 h后, 蛋白核小球藻荧光中心处的荧光值显著降低, 四种重金属离子对藻细胞光合系统的叶绿素a和叶绿素b造成了严重的破坏。 进一步分析四种重金属离子浓度与由同步扫描荧光光谱得到的藻荧光猝灭效率I0/I的相关性可知: 重金属离子的毒性与荧光猝灭效率I0/I呈正相关关系, 均随重金属离子浓度和胁迫时间的增加而增强。 对某一种重金属而言, 同步扫描荧光光谱可实现藻细胞对该重金属毒性的评价。 与三维荧光光谱相比, 同步扫描荧光光谱具有耗时少、 对特定荧光中心选择性高等优点, 是研究水体有毒污染物毒性的有利工具。