苏云金芽胞杆菌(Bt)中绝大多数杀虫晶体蛋白(ICPs)的表达依赖于芽胞形成, 为了从细胞水平研究晶体与芽胞形成之间的关系, 本文选用Bt 4.0718与工程菌Bt ΔleuB为研究对象, 利用FM4-64对不同生长阶段的菌体细胞染色, 并用激光共聚焦扫描显微镜进行了对比观察和分析。结果显示,Bt 4.0718芽胞的发育依次经历了不对称隔膜和内吞形态学阶段后, 能顺利进入下一个发育阶段, 直至完成芽胞发育过程后母细胞凋亡裂解; 而Bt ΔleuB细胞进入不对称隔膜期的时间明显延迟, 且芽胞发育被阻滞于内吞阶段, 伴胞晶体形成最早于不对称隔膜期可见, 并且晶体体积继续增大直至细胞死亡。qRT-PCR结果显示, σE、spoIIR和spoIIGA的高水平转录是维持Bt ΔleuB细胞中ICPs正常表达的关键因素。本研究结果对进一步揭示晶体与芽胞形成之间的关系及构建性状优良Bt工程菌具有一定的参考价值。

山东省德州市禹城市和湖南省长沙市望城区分别属于我国北方和南方地区, 环境和气候差异明显。本试验以禹城市和望城区两地的草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鲫鱼(Carassius auratus)和鲤鱼(Cyprinus carpio)为研究对象, 对肠道中的菌群进行16s rRNA V4高变区扩增, 基于IonS5TM XL测序平台进行测序, 并对相关数据进行分析。结果表明, 在门水平上鲫鱼、鲤鱼、草鱼的肠道优势菌主要为变形菌门(Proteobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes), 拟杆菌门(Bacteroidetes), 各组中这四种菌门所占比之和均在80%以上; 基于Bray-Curtis距离值的秩次进行组间差异显著性检验, 山东草鱼组和湖南草鱼组比较中组间差异大于组内差异(R=0.307, P<0.05), 且线性判别分析显示湖南草鱼组的特征性菌群为弧菌属, 而山东草鱼组的为梭菌纲, 推测特征性菌群差异与环境的影响有关; 有害菌种的统计分析表明, 湖南鲫鱼组和鲤鱼组的嗜水气单胞菌属相对丰度明显高于对应的山东鲫鱼组和鲤鱼组, 山东草鱼组和鲤鱼组的弧菌属相对丰度高于对应的湖南草鱼组和鲤鱼组, 可能受外界环境的影响, 不同地区抵御外来有害细菌的能力也不一样。本研究对两地的淡水鱼类肠道微生物群落结构进行了比较和分析, 为进一步的鱼类发育研究奠定基础。

本研究利用Red/ET DNA重组技术对实验室已有的含鼠李糖基转移酶基因RhlAB的分泌表达载体pBBR1-genta-RhlAB进行修饰, 将3种不同强度组成型启动子(Papra、Ptac和PrhaB)成功替换了RhlAB基因在铜绿假单胞菌中的原始启动子, 成功获得了表达载体pBBR1-genta-Papra-RhlAB, pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB, 并将这些表达载体分别在防御假单胞菌Pf-5中异源表达, 通过LB培养基发酵42 h后, Pf-5/pBBR1-genta-RhlAB的鼠李糖脂产量为17.56 mg/L, 而Pf-5/pBBR1-genta-Papra-RhlAB, Pf-5/pBBR1-kan-Ptac-RhlAB和Pf-5/pBBR1-kan-PrhaB-RhlAB分别是11.135 mg/L, 441.135 mg/L, 557.764 mg/L, 启动子优化后产量分别是原始启动子的0.63, 25.12和31.76倍。对发酵产物进行高效液相色谱-质谱联用技术分析, 共检出相对含量变化的4类质核比不同的鼠李糖脂同系物。并通过实时荧光定量PCR检测RhlAB基因的表达量, 发现启动子替换为Ptac和PrhaB后RhlAB基因表达量分别是原始启动子的2.16和2.77倍。本研究初步实现了RhlAB基因在Pf-5中的表达, 发现组成型启动子Ptac和PrhaB比RhlAB的原始启动子表达效率更高, 可为异源合成鼠李糖脂提供重要参考。

对荚壳伯克氏菌PG1(Burkholderia glumae PG1)基因组中的脂肪酶操纵子lipAB片段进行直接克隆, 构建含有脂肪酶基因的分泌表达载体, 实现其在防御假单胞菌Pf-5(Pseudomonas protegens Pf-5)中的异源表达, 并研究重组工程菌的胞外脂肪酶活性。利用 Red/ET直接克隆技术获得克隆载体p15A-cm-lipAB; 再通过亚克隆技术构建重组表达载体pBBR1-km-lipAB和pBBR1-km-Papra-lipAB, 将这两个表达载体分别电转至Pf-5中, 通过卡那霉素或者阿伯拉霉素抗性筛选得到转化子, 以三丁酸甘油酯平板扩散法和对硝基苯酚法检测脂肪酶酶活, 并通过实时荧光定量PCR检测启动子的替换对lipA表达的影响。本研究从PG1中成功克隆了脂肪酶操纵子lipAB(GenBank accession number:AJK49931.1 and AJK49932.1); 成功构建了重组工程菌Pf-5/pBBR1-km-lipAB和Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB, 并成功检测到两株工程菌的胞外脂肪酶活性; 以LB培养基培养至24 h时, 启动子优化后lipA基因表达量是原始水平的2.1倍; 在LB培养基摇瓶发酵至66 h时, Pf-5/pBBR1-km-lipAB的脂肪酶酶活最高且为13.51 U/mL, 而Pf-5/pBBR1-km-Papra-lipAB的酶活为46.85 U/mL, 是Pf-5/pBBR1-km-lipAB的3.47倍。初步实现基因lipA在Pf-5中的表达, 发现组成型启动子Papra比lipAB的原始启动子PlipAB效率更高, 为将来实现规模化生产奠定了技术基础。

本研究通过NCBI数据分析得知Photorhabdus luminescens TT01基因组中表达Tc毒素蛋白复合体的基因簇包含了6个相关的Tc毒素基因, 分别为tcaZCB(plu0514-0515)、tccAB3(plu0805-0806)、tccAB1(plu4165-4169)、tcd(plu0960-0971)、tccC4(plu0976)和tccC7(plu4488)。利用Red/ET直接克隆技术, 快速获得发光杆菌TT01基因组DNA上的4个Tc毒素基因tcaZCB(6 804 bp)、tccAB3(7 419 bp)、tccAB1(10 954 bp)和tcd(51 406 bp)分别构建到相应的重组质粒p15A-cm-tcaZCB、p15A-cm-tccAB3、p15A-cm-tccAB1和p15A-cm-tcd上。通过PCR技术分别扩增得到tccC4基因(2 891 bp)和tccC7基因(2 871 bp), 并进行T载体连接后, 分别获得质粒pMD18-tcc4和pMD18-tcc7。本研究通过两种不同的生物技术方法成功克隆到发光杆菌TT01基因组上的Tc毒素蛋白复合体的所有相关基因, 为后续的研究打下一定的基础。

从我国不同地区采集118份土样，利用温度筛选法分离获得一株苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）6618，镜检观察发现该菌株能产生典型的菱形晶体，PCR分析表明其含有cry1类杀虫基因。采用SDS-PAGE和质谱分析发现该菌株主要产生130 kD原毒素，其组分由Cry1Ae和Cry1Ac原毒素组成。基因序列分析表明该菌株的cry1Ac基因为已知的cry1Ac1，而cry1Ae为新型杀虫基因。毒力生测表明该菌株对棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫具有显著的杀虫效果。筛选获得的高毒力Bt菌株6618为丰富我国苏云金芽胞杆菌储备和研发新型高效生物杀虫剂提供了菌株资源。

将强启动子P43与透明颤菌血红蛋白基因(vgb)通过重叠延伸PCR进行融合, 克隆到芽孢杆菌整合表达载体pDG1730中, 重组表达载体pDG-P43vgb转化促生防病解淀粉芽孢杆菌FZB42, Wsetern-Blot和CO差光谱分析表明重组菌株FZB42-VHb表达了有活性的VHb蛋白, VHb的表达对重组菌株菌体的生长及抗菌脂肽的产生都有促进作用。在相同培养条件下, 重组菌最大菌体密度比原始菌株提高了14.49 %, 抗菌脂肽fengycin的产量提高了1.74倍, 抗菌脂肽surfactin的产量提高了3.14倍。

在基因库中比对14种cry1Ac基因序列,发现了同源性很高的上游启动子区域和下游终止子区域.根据这一同源序列设计引物,从Bt4.0718中扩增出包含双启动子和终止子的4.2 kb片段,用PCR-RFLP检测确定其中含有cry1Ac基因.然后将此片段克隆到穿梭载体pHT304中,转化大肠杆菌DH5α和Bt无晶体突变株XZM-101.同时,利用原子力显微镜观察发现重组菌株BXZM34能够产生菱形晶体.

营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Protein,Vip)Vip3A是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养生长对数中期分泌产生的一类新型杀虫蛋白.Vip3A广泛存在于Bt中,与晶体杀虫蛋白(InsecticidalCrystal Proteins,ICPs)没有任何同源性,不具有多样性,在遗传上比较保守.其N-端存在一趋化信号传导因子相似序列,C-端存在着纤维素结合结构域.Vip3A蛋白通过诱发细胞凋亡,最终导致细胞死亡,这与Bt δ-内毒素的作用机理完全不同.本文主要对Vip3A杀虫蛋白的发现、特性及作用机理作一简要综述.