黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的心脏发育调控基因与人类的相关基因具有高度同源性。Lbe基因是果蝇心脏发育的重要调控基因。为了深入研究Lbe基因在心脏发育中的调控功能, 采用DNA免疫技术制备了抗果蝇Lbe蛋白的多克隆抗体。通过PCR扩增Lbe基因序列, 将该序列与真核表达载体pCAGGS-P7同源重组, 以该同源重组载体免疫4周龄小鼠, 获得含有抗Lbe多克隆抗体的血清。蛋白质印迹(Western blot)和胚胎抗体染色结果表明, 该抗体的特异性较好。该抗体为随后的Lbe功能的研究奠定了基础。

研究果蝇的心脏发育基因表达调控机制, 其相应靶点的抗体必不可少。但目前市场上缺乏此类商用抗体, 因此本研究选择果蝇心脏发育中的标记基因Svp(Seven-up), 并采用DNA免疫技术来快速制备其抗体。首先通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出Svp基因编码区部分序列, 然后将其连接到真核表达载体pCAGGS-P7上, 再将重组质粒pCAGGS-P7-Svp直接注射进小鼠体内, 使外源基因在活体内表达, 产生的抗原激活了小鼠的特异性细胞免疫和体液免疫, 从而分泌相应的抗体, 取小鼠的血清收集获得抗体。最后用蛋白质印迹(Western blot)和胚胎免疫荧光技术检测Svp抗体的效价和特异性。结果表明, 制备的Svp多克隆抗体具有高效价和特异性, 为后续的果蝇心脏发育研究奠定了基础。

TGF-β信号家族在生物体生命活动中具有多种发育和生理功能。研究该信号家族在生物体内的表达模式具有重要的意义。gbb是TGF-β信号成员bmp7的果蝇同源基因,为了进一步研究gbb对胚胎发育的影响, 本文采用DNA免疫技术制备得到果蝇GBB多克隆抗体。首先提取果蝇总RNA, 反转录得到cDNA文库,以该文库为模板克隆出gbb基因编码区序列, 构建成真核表达质粒pCAGGS-P7/gbb。采用DNA免疫技术免疫BALB/c小鼠, 取心血分离血清制备了GBB多克隆抗体。免疫印迹试验表明制备的GBB多克隆抗体有效,果蝇胚胎免疫荧光分析表明GBB在果蝇胚胎发育0~9 h无明显表达, 9 h之后开始高效表达。

Wnt16属于非经典wnt信号途径上的一员, 目前有大量的研究表明wnt16与胚胎的血液发育和骨骼发育相关。为了阐明wnt16在造血过程中的调控机制, 利用RT-PCR(逆转录PCR)扩增斑马鱼wnt16基因的ORF(开放阅读框)序列全长, 构建真核表达载体pCAGGS-P7/wnt16, 测序正确后, 用该表达载体免疫BALB/c雌鼠, 进行DNA免疫, 制备斑马鱼抗WNT16特异性多克隆抗体。结果表明: 通过DNA免疫制备的斑马鱼抗WNT16抗血清能特异性识别WNT16蛋白。斑马鱼WNT16抗体成功制备为进一步的功能研究奠定了重要基础。

ASB11参与胚胎神经祖细胞的发育、再生性肌发生以及泛素化等过程,但其机制仍不清楚。为了进一步研究斑马鱼Asb11基因的作用机制,本研究采用DNA免疫技术制备了ASB11多克隆抗体；利用斑马鱼Asb11的cDNA构建pCAGGS-P7/ASB11重组表达质粒,肌肉注射入6-8周龄的BALB/c小鼠体内,诱导抗原蛋白的表达和免疫应答的发生。结果显示,制备的pCAGGS-P7/ASB11重组质粒具有较好的免疫原性；将提取的抗血清进行Western-blot和免疫荧光检测,显示所制备的多克隆抗体抗体效价为1∶400,抗血清抗体能特异的结合ASB11蛋白。本研究为后续的功能研究奠定了基础。

转录因子GATA1对正常红系细胞的分化起着关键作用, 其缺失导致原成红细胞的凋亡, 其过表达则能抑制红系细胞晚期的分化。本研究为了进一步利用斑马鱼研究gata1基因在血液血管发育过程中的功能, 通过反转录PCR(RT-PCR)扩增了斑马鱼gata1基因编码区序列, 构建了真核表达质粒pCAGGS-P7/gata1, 采用质粒DNA免疫技术的方法免疫了BALB/c小鼠, 制备了斑马鱼GATA1蛋白多克隆抗体。实验结果表明: 构建的真核表达重组质粒pCAGGS-P7/gata1 DNA具有良好的免疫原性, 在免疫小鼠后所获得的抗血清抗体效价达1∶500。Western blot和免疫荧光检测表明, 抗血清能特异型地识别GATA1蛋白。斑马鱼GATA1抗体成功制备为进一步的功能研究奠定了重要基础。

目的: 构建小鼠睾丸特异性基因Vad1.2重组蛋白, 制备多克隆抗体。方法: 将小鼠睾丸组织Vad1.2转录本行RT-PCR扩增, 通过DNA重组技术插入克隆载体pET15b, 进行酶切及DNA序列分析。将表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)RIL感受态细胞, 10 mmol/L IPTG诱导表达重组蛋白, 通过10% SDS-PAGE、Western blotting及质谱分析进行鉴定。随后对重组Vad1.2蛋白进行纯化和进一步鉴定。最后, 制备兔抗小鼠Vad1.2多克隆抗体, 并通过Vad1.2-EGFP质粒转染GC-2spd(ts)细胞对其特异性进行验证。结果: 大肠杆菌BL21(DE3)RIL细胞中诱导表达并纯化的小鼠Vad1.2重组蛋白构建正确并经Western blotting和质谱分析得到证实。所制备的多克隆抗体可特异性识别GC-2spd(ts)细胞中过表达的Vad1.2-EGFP融合蛋白。结论: 成功构建小鼠Vad1.2重组蛋白, 并制备多克隆抗体, 为Vad1.2基因的进一步研究奠定了实验基础。

Fbxl5为F-box基因家族的一员, 目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能, 有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段, 将其克隆入表达载体pET-28a, 转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化, 将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测, 获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达, 通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体, 为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。

Kruppel在果蝇发育过程中起着重要的调控作用。为了进一步研究Kruppel的功能, 需要制备Kruppel蛋白及其抗体.对已有的Kruppel序列进行分析, 选取适当区域进行引物设计, 从果蝇心脏cDNA文库中PCR扩增得到Kruppel部分编码区序列, 并其连接到pET-28a载体上。将重组质粒(pET-28a-Kruppel)转化rosetta受体菌, 通过IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactoside)诱导表达融合蛋白, 用镍柱进行亲和纯化。将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体, 并用Western blot检测抗体的效价。

lbe是已经证明的心脏标记基因。为了深入研究lbe在心脏发育中的功能, 需要获得lbe蛋白并制备其抗体。首先提取野生型成体果蝇的总RNA, 反转录获得其cDNA文库, 通过PCR克隆出lbe编码区序列, 将其连接到pET-28a原核表达载体上。经酶切及测序鉴定后, 质粒构建成功。将重组质粒(pET-28a-lbe)转化大肠杆菌菌株Rosseta,用IPTG诱导表达出融合蛋白, 经Ni-IDA凝胶柱纯化后, 最后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备lbe多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体的效价和特异性。结果显示获得了lbe原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗lbe多克隆抗体, 为lbe功能的进一步研究奠定了基础。